Chromatografia

Wybór kapilar dla różnych prędkości przepływu

ID	Pływ	Kolor	Z
0,13 mm	Do 2,0 ml/min	Czerwony	1/16"
0,18 mm	Do 5,0 ml/min	Żółty	1/16"
0,25 mm	Do 20 ml/min	Niebieski	1/16"
0,50 mm	Do 50 ml/min	Pomarańczowy	1/16"
0,75 mm	Do 100 ml/min	Zielony	1/16"
1,0 mm	Do 200 ml/min	Szary	1/16"
1,59 mm	Do 500 ml/min		1/8"".
2,40 mm	Do 1000 ml/min		1/8"".

Cale do mm - cale x 25,4 = mm

Stopy na metr - stopy x 0,3048 = metr

Ciśnienie w kolumnie przy szybkości przepływu 1 ml/min

P = 2,1 xdx 10,13 xh / h ² x vp ²

P – ciśnienie (MPa)
L – długość kolumny w mm
h - lepkość dynamiczna (dla wody = 1)
d – średnica wewnętrzna kolumny w mm
vp – wielkość cząstek w µm

Ciśnienie na kolumnie 4,6 x 250 mm, 5 um wyniesie ok. 100 barów przy szybkości przepływu 1,0 ml/min

Wybór kolumny w zależności od wielkości wtrysku i jego wydajności

ID (mm)	Wartość wtrysku (µl)	Pojemność kolumny (mg)	Przepływ (ml/min)
4,6	5-100	1	0,5 - 2,0
10	100-1000	5	4,0 - 15,0
21,2	1000-5000	20	10 – 50
30	2000 – 10 000	40	40 – 100
50	5000 – 20 000	120	100-300
100	10 000 – 50 000	500	400–1000

pK kwasów i zasad stosowanych jako dodatek do faz ruchomych HPLC

pK _oraz bufory kwasowe i zasadowe w HPLC do przygotowania fazy ruchomej

Bufor kwasowy	Temperatura (°C)	pK ₁	pK ₂		pK ₃
ACES kwas 2-[(2-amino-2-oksoetylo)amino]etanosulfonowy	20	6,9	-		-
Kwas octowy	25	4,8	-		-
Kwas borowy	20	9,1	12,7		13,8
CAPS kwas 3-(cykloheksyloamino)etanosulfonowy	20	10,4	-		-
Kwas cytrynowy	25	3.1	4,8		6,4
Kwas mrówkowy	20	3,8	-		-
Glicyna	25	2,3	9,6		-
Glicyloglicyna	20	8.4	-		-
HEPES Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowy	20	7,6	-		-
imidazol	20	7,0	-		-
MES Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy	20	6,2	-		-
MOPS kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy	20	7,2	-		-
Kwas szczawiowy	25	1,3	4,3		-
Kwas fosforowy	25	2,1	7,2		12,7
TES kwas 2-[tris(hydroksymetylo)metylo]aminoetanosulfonowy	20	7,5	-		-
Kwas trifluorooctowy	25	0,3	-		-
Tricyna N-[tris(hydroksymetylo)metylo]glicyna	20	8,2	-		-
TRIS Tris(hydroksymetylo)aminometan	20	8,3	-		-
_pKb zasad w HPLC do przygotowania fazy ruchomej
Zaszczepiony bufor	temperatura (°C)	pK ₁	pK ₂	pK ₃
Amoniak	25	9,3	-	-
dietyloamina	20	11.1	-	-
dimetyloamina	25	10,7	-	-
Etyloamina	20	10,8	-	-
Etylenodiamina	20	10.1	7,0	-
metyloamina	25	10,7	-	-
Morfolina	25	8,3	-	-
trietyloamina (TEA)	18	11,0	-	-
trimetyloamina	25	9,8	-	-

Uwaga: Zakres pH, dla którego jest odpowiedni, mieści się w zakresie pK ± 1. Należy wziąć pod uwagę wartość odcięcia UV stosowanego buforu (tabela 2)

Zastosowanie i wsparcie w UHPLC

Chronometr Transfer metody (od konwencjonalnej HPLC do UHPLC)

Pojemność próbki (w jaki sposób mniejsze cząstki wpływają na pojemność próbki?)

Transfer metod do UHPLC

Przenoszenie metod z klasycznej HPLC do UHPLC wymaga najpierw optymalizacji selektywności i wydajności kolumny dla pożądanego zastosowania. Po zakończeniu tej części opracowania metody możemy przejść do przeniesienia metody do UHPLC. Aby to zrobić, będziemy mogli wykorzystać nieskomplikowane obliczenia, aby pomóc w ustaleniu równoważnych warunków separacji. Artykuł ten jest stopniowo opisywany.

Wybór długości kolumny

Pierwsze obliczenie określa odpowiednią długość kolumny chromatograficznej. Utrzymując długość kolumny i zmniejszając rozmiar cząstek, zwiększa się liczba teoretycznych łat na kolumnie. Dlatego możemy skrócić kolumnę bez utraty rozróżnienia. Stosując wzór 1 i wybierając odpowiednią długość kolumny, zachowamy ten sam rozdział jak dla HPLC z węzłem.

Optymalizacja objętości wtrysku

Po ustaleniu odpowiedniej długości kolumny możemy zoptymalizować objętość wtrysku. Poprzez zmniejszenie średnicy wewnętrznej i długości kolumny zmniejsza się całkowita objętość i pojemność próbki. Dlatego musimy dostosować objętość opryskiwania zgodnie ze wzorem 2 . W tym przypadku należy zdać sobie sprawę, że przez zmniejszenie całkowitej objętości kolumny bardzo ważne jest zapewnienie kompatybilności próbki rozpuszczalnika z kompozycją fazy ruchomej. W przeciwnym razie mogą wystąpić czasy retencji, wydajność, a nawet zmiana w selektywności.

Ustawienie przepływu

Natężenie przepływu musi być ustawione tak, aby zapewnić odpowiednią prędkość liniową dla mniejszej kolumny. Jest to zdefiniowane jako odległość osiągnięta przez fazę ruchomą przez jednostkę czasu (w przeciwieństwie do prędkości przepływu, która jest zdefiniowana jako objętość fazy ruchomej przechodzącej przez kolumnę chromatograficzną w czasie). Aby utrzymać taką samą prędkość liniową, która jest ważna dla utrzymania wydajności, natężenie przepływu fazy ruchomej musi zostać zmniejszone poprzez zmniejszenie średnicy kolumny. W przypadku separacji izokratycznej przepływ w kolumnie można obliczyć zgodnie ze wzorem 3 (należy również wziąć pod uwagę wielkość cząstek). Powinno to być szybkie i łatwe oszacowanie ustawienia natężenia przepływu dla równoważnej chromatografii. W tym miejscu należy zauważyć, że cząstki mniejsze niż 2 μm są mniej podatne na większe prędkości przepływu, a zatem można stosować większe szybkości przepływu w separacjach izokratycznych bez szkodliwego wpływu na skuteczność oddzielania.

Ustawianie programu czasowego

Na koniec, po zoptymalizowaniu długości kolumny, objętości oprysku i przepływu, możemy przejść do początku gradientu. Przenosząc metodę z konwencjonalnej HPLC do UHPLC, musimy jednocześnie dopasować interakcję gradientu do faz. Tutaj ustawiamy to za pomocą wzoru 4 .

Literatura: Rick Lake, Restek Corporation

Lepkość rozpuszczalników

Zależność lepkości mieszanin rozpuszczalników od ich składu procentowego

% wody	lepkość (MeOH / woda)	lepkość (AcCN / woda)
0	0,65	0,35
10	0,95	0,50
20	1,20	0,55
30	1,60	0,70
40	1,75	0,80
50	1,90	0,90
60	1,80	1,00
70	1,75	1,05
80	1,65	1.10
90	1,40	1,05
100	1,00	1,00

Wykresy do chromatografii

Wybór kapilary dla różnych prędkości przepływu

Dobór kolumny w zależności od wielkości natrysku i pojemności kolumny

Dodatek odcięcia UV dla faz mobilnych

pK _i kwaśne bufory w fazach ruchomych do HPLC

_pks zasady w fazie ruchomej do HPLC

Konwersja jednostek ciśnienia

Oszacowanie ciśnienia na kolumnach, w zależności od wielkości cząstek, średnicy i długości kolumny

Lepkość mieszanin rozpuszczalników

Właściwości rozpuszczalnika

Carbotrap X

Parametr	Charakterystyka
Siła / rodzaj adsorbentu	średniej mocy sorbent na bazie czarnego węgla
Specjalna powierzchnia	ok. 240 m ² / g
Przybliżony zakres zmienności	nC _3/4 do nC _6/7 (temperatura wrzenia od 50 do 150 ° C)
Przykłady analitów	lekkie węglowodory, 1,3-butadien, benzen (do 2-tygodniowego pobierania próbek duluth)
Maksymalna temperatura adsorbentu	> 400 ° C
Zalecana temperatura kondycjonowania	350-400 ° C
Zalecana temperatura desorpcji	350 do 400 ° C (poniżej temperatury kondycjonowania)

Dowiedz się więcej

hydrofobowy
minimalna zawartość własnych artefaktów (<0,1 ng)
metale śladowe z produkcji powodują aktywność sorbentu
kruchy - z łatwością tworzy drobne cząstki w mechanicznym szoku. Unikaj wpływu rur sorpcyjnych zawierających ten sorbent.
Możliwość ściśnięcia - przepełnienie może spowodować większy opór i wpłynąć na natężenie przepływu pompy
zalecana wielkość ziarna probówek sorpcyjnych i " pułapki na zimno " wynosi 40/60 oczek
zalecane odzyskiwanie sorpcji po 200 cyklach termicznych

Carbopack X

Parametr	Charakterystyka
Siła / rodzaj adsorbentu	średniej mocy sorbent na bazie czarnego węgla
Specjalna powierzchnia	ok. 240 m ² / g
Przybliżony zakres zmienności	nC _3/4 do nC _6/7 (temperatura wrzenia od 50 do 150 ° C)
Przykłady analitów	lekkie węglowodory, 1,3-butadien, benzen (do 2-tygodniowego pobierania próbek duluth)
Maksymalna temperatura adsorbentu	> 400 ° C
Zalecana temperatura kondycjonowania	350-400 ° C
Zalecana temperatura desorpcji	350 do 400 ° C (poniżej temperatury kondycjonowania)

Dowiedz się więcej

hydrofobowy
minimalna zawartość własnych artefaktów (<0,1 ng)
metale śladowe z produkcji powodują aktywność sorbentu
kruchy - z łatwością tworzy drobne cząstki w mechanicznym szoku. Unikaj wpływu rur sorpcyjnych zawierających ten sorbent.
Możliwość ściśnięcia - przepełnienie może spowodować większy opór i wpłynąć na natężenie przepływu pompy
zalecana wielkość ziarna probówek sorpcyjnych i " pułapki na zimno " wynosi 40/60 oczek
zalecane odzyskiwanie sorpcji po 200 cyklach termicznych

Tenax GR

Parametr	Charakterystyka
Siła / rodzaj adsorbentu	słaby porowaty polimer
Specjalna powierzchnia	ok. 35 m ² / g
Przybliżony zakres zmienności	nC ₇ do nC ₃₀ (od 100 do 450 ° C)
Przykłady analitów	związki aromatyczne (z wyjątkiem benzenu), związki niepolarne o masie cząsteczkowej> 100 ° C, związki polarne o masie cząsteczkowej> 150 ° C, WWA, PCB
Maksymalna temperatura adsorbentu	350 ° C
Zalecana temperatura kondycjonowania	do 325 ° C
Zalecana temperatura desorpcji	do 300 ° C

Dowiedz się więcej

hydrofobowy
mała zawartość własnych artefaktów (<1 ng)
obojętny - odpowiedni do niestabilnych związków
Tenax GR (forma graficzna) jest najbardziej odpowiednia dla PAH i PCB
efektywna desorpcja
maksymalna temperatura sorbentu nie może zostać przekroczona, ponieważ wystąpiłby rozkład sorbentu i parowanie, co mogłoby doprowadzić do zanieczyszczenia szlaków gazowych
zalecana wielkość ziarna probówek sorpcyjnych i " pułapki na zimno " wynosi 35/60 oczek
zalecane odzyskiwanie sorpcji po 100 cyklach termicznych