Transfer metod do UHPLC

Przenoszenie metod z klasycznej HPLC do UHPLC wymaga najpierw optymalizacji selektywności i wydajności kolumny dla pożądanego zastosowania. Po zakończeniu tej części opracowania metody możemy przejść do przeniesienia metody do UHPLC. Aby to zrobić, będziemy mogli wykorzystać nieskomplikowane obliczenia, aby pomóc w ustaleniu równoważnych warunków separacji. Artykuł ten jest stopniowo opisywany.

Wybór długości kolumny

Pierwsze obliczenie określa odpowiednią długość kolumny chromatograficznej. Utrzymując długość kolumny i zmniejszając rozmiar cząstek, zwiększa się liczba teoretycznych łat na kolumnie. Dlatego możemy skrócić kolumnę bez utraty rozróżnienia. Stosując wzór 1 i wybierając odpowiednią długość kolumny, zachowamy ten sam rozdział jak dla HPLC z węzłem.

Optymalizacja objętości wtrysku

Po ustaleniu odpowiedniej długości kolumny możemy zoptymalizować objętość wtrysku. Poprzez zmniejszenie średnicy wewnętrznej i długości kolumny zmniejsza się całkowita objętość i pojemność próbki. Dlatego musimy dostosować objętość opryskiwania zgodnie ze wzorem 2 . W tym przypadku należy zdać sobie sprawę, że przez zmniejszenie całkowitej objętości kolumny bardzo ważne jest zapewnienie kompatybilności próbki rozpuszczalnika z kompozycją fazy ruchomej. W przeciwnym razie mogą wystąpić czasy retencji, wydajność, a nawet zmiana w selektywności.

Ustawienie przepływu

Natężenie przepływu musi być ustawione tak, aby zapewnić odpowiednią prędkość liniową dla mniejszej kolumny. Jest to zdefiniowane jako odległość osiągnięta przez fazę ruchomą przez jednostkę czasu (w przeciwieństwie do prędkości przepływu, która jest zdefiniowana jako objętość fazy ruchomej przechodzącej przez kolumnę chromatograficzną w czasie). Aby utrzymać taką samą prędkość liniową, która jest ważna dla utrzymania wydajności, natężenie przepływu fazy ruchomej musi zostać zmniejszone poprzez zmniejszenie średnicy kolumny. W przypadku separacji izokratycznej przepływ w kolumnie można obliczyć zgodnie ze wzorem 3 (należy również wziąć pod uwagę wielkość cząstek). Powinno to być szybkie i łatwe oszacowanie ustawienia natężenia przepływu dla równoważnej chromatografii. W tym miejscu należy zauważyć, że cząstki mniejsze niż 2 μm są mniej podatne na większe prędkości przepływu, a zatem można stosować większe szybkości przepływu w separacjach izokratycznych bez szkodliwego wpływu na skuteczność oddzielania.

Ustawianie programu czasowego

Na koniec, po zoptymalizowaniu długości kolumny, objętości oprysku i przepływu, możemy przejść do początku gradientu. Przenosząc metodę z konwencjonalnej HPLC do UHPLC, musimy jednocześnie dopasować interakcję gradientu do faz. Tutaj ustawiamy to za pomocą wzoru 4 .

Literatura: Rick Lake, Restek Corporation