MetAmino - zestaw do przygotowania próbki

Wstęp

Aminokwasy są kluczowymi elementami budulcowymi życia i odgrywają kluczową rolę w różnych szlakach metabolicznych. Działają głównie jako półprodukty, często niezwiązane bezpośrednio z białkami. Ze względu na ich złożoność chemiczną i zakres dynamiczny, ich wiarygodna analiza ilościowa i jakościowa w płynach biologicznych i tkankach ma kluczowe znaczenie dla informacji o wartościach odżywczych, identyfikacji związków i diagnostyki.

W tym celu opracowano prostą, elegancką i jak dotąd najszybszą metodę analizy bezcennych aminokwasów. Zestaw Metamino® oparty na LC/GC-MS oferuje kompleksowe rozwiązanie aż do 75 metabolitów, w tym podstawowych aminokwasów proteinogennych, amin biogennych i koenzymów, z możliwością dalszego rozszerzenia analitu.

Cechy

• W zasadzie nadaje się do wszelkich matryc (mocz, surowica krwi, łza, płyn mózgowy, ekstrakty tkankowe, ekstrakty glebowe itp.)
• Łatwe przygotowanie próbki
• Derywatyzacja i analiza próbek w czasie krótszym niż 20 minut
• Szerokie portfolio analitów (75) z możliwością dalszej rozbudowy
• Nie ma potrzeby podgrzewania/zamrażania próbki
• Dostępna biblioteka NIST dla GC/MS
• Możliwość oznaczania substancji o niskiej masie cząsteczkowej, które mogą ulegać rozkładowi w źródle jonów (np. GLY, ALA itp.)
• Nadaje się do analizy substancji trudnych do określenia ilościowego, takich jak poliaminy
• W zestawie znajdują się wszystkie niezbędne odczynniki, akcesoria, kolumna HPLC i jasne instrukcje dotyczące derywatyzacji i analizy z dużą dokładnością i czułością

Dane chromatogramu masowego

Ogromny. 1: Chromatogram masowy wzorców wewnętrznych, SD1 i SD2. Oddzielenie 5 nmol aminokwasów metodą LC-MS Metamino®

Ogromny. Ryc. 2: Chromatogram masowy próbki rzeczywistej: Rozdział aminokwasów w formule piwa Budvar 12˚ (na kolumnę naniesiono 25 µl próbki). Wysoka wydajność i wysoka rozdzielczość naszej kolumny przyczyniają się do dobrej separacji pików. Próbka testowana metodą LC-MS Metamino®

Ogromny. Ryc. 3: Chromatogram masowy próbki rzeczywistej: Rozdział aminokwasów obecnych w surowicy krwi (na kolumnę nałożono 25 µl wytrąconej surowicy). Wysoka wydajność i wysoka rozdzielczość naszej kolumny przyczyniają się do dobrej separacji pików. Próbka testowana metodą LC-MS Metamino®

przygotowanie próbki

Po wyodrębnieniu zawartości z matrycy można przystąpić do przygotowania próbki do analizy LC-MS/GC-MS.

Protokół ten jedynie w skrócie opisuje procedurę przygotowania próbki. Szczegółową procedurę można znaleźć w instrukcji obsługi Metamino^®.

Analiza LC-MS przebiega w następujący sposób:

1. Odpipetuj 100 μl wyekstrahowanej zawartości (surowicy, osocza, ...) i dodaj 100 μl podłoża wytrącającego. Wiruj przez 30 do 60 sekund przy 1500 g (6000 obr/min).
2. Odpipetuj 25 µl wytrąconej próbki i dodaj 10 µl roztworu wzorca wewnętrznego do każdej fiolki do przygotowania próbki.
3. Odpipetuj 25 μl roztworu katalizatora do każdej fiolki do przygotowania próbki i wiruj przez 5-10 sekund.
4. Odpipetuj 10 μl roztworu odczynnika do każdej fiolki do przygotowania próbki i wiruj przez 5-10 sekund. Pozwól, aby derywatyzacja przebiegała przez co najmniej 2-3 minuty.
5. Aktywuj i zrównoważ sorbent w filtrze mikrowirowym dodając:
   1. 200 µl podłoża aktywacyjnego MSPE, następnie wirować przez 30 do 60 sekund przy 1500 g (6000 obr/min).
   2. 200 µl podłoża do równoważenia sorbentu MSPE, następnie wirować przez 30 do 60 sekund przy 1500 g (6000 obr/min).
6. Wylać płyn przez membranę.
7. Rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną derywatyzacji 400 µl środka do rozcieńczania i przemywania i wirować przez 5-10 sek.
8. Nałożyć rozcieńczoną mieszaninę reakcyjną (zwykle 450-500 µl) na zwilżony sorbent z filtrem mikrowirowym i odstawić na 1-2 minuty. Wiruj przez 30 do 60 sekund przy 1500 g (6000 obr/min).
9. Wylać płyn przez membranę.
10. Przemyć sorbent w filtrze mikrowirówkowym 200 µl rozcieńczenia i medium płuczącego, a następnie wirować przez 30 do 60 sekund przy 1500 g (6000 obr/min).
11. Umieścić filtr mikrowirówkowy w nowej fiolce wirówkowej, dodać 200 µl medium elucyjnego i wirować przez 30 do 60 sekund przy 1500 g (6000 obr/min).
12. Przenieść eluat do fiolki autosamplera. Próbka jest gotowa do analizy LC-MS.

Analiza GC-MS przebiega w następujący sposób:

1. Odpipetować 25 µl próbki docelowej i 10 µl roztworu wzorca wewnętrznego do każdej szklanej probówki reakcyjnej.
2. Odpipetować 20 µl środka redukującego do każdej szklanej probówki reakcyjnej i krótko wstrząsać przez 5 do 10 sekund. Odstaw na 1 do 2 minut.
3. Odpipetować 25 µl podłoża podstawowego do każdej szklanej probówki reakcyjnej i dodać 50 µl roztworu odczynnika (derywatyzacji) do każdej szklanej probówki reakcyjnej i wirować przez 5 do 10 sekund.
4. Odpipetować 25 µl roztworu katalizatora do każdej fiolki do przygotowania próbki i wirować przez 5 do 10 sekund.
5. Odpipetować 25 µl roztworu katalizatora do każdej fiolki do przygotowania próbki i wirować przez 5 do 10 sekund. Odstaw na 1-2 minuty. Emulsję stopniowo dzieli się na dwie warstwy.
6. Odpipetuj 50 μl ośrodka ekstrakcyjnego do każdej fiolki do przygotowania próbki i wiruj przez 5 do 10 sekund.
7. Odpipetuj 25 μl kwaśnego podłoża do każdej fiolki do przygotowania próbki i wiruj przez 5 do 10 sekund. Następnie wiruj przez 30 do 60 sekund przy 1500 g (6000 obr/min).
8. Przenieść warstwę organiczną (górną) (50-100 µl) do fiolki autosamplera z wkładką. Próbkę przygotowuje się do analizy GC-MS.

Zawartość zestawu

Zestaw MetAmino ^® zawiera wszystkie odczynniki, pożywki i chemikalia. Zawartość zestawu startowego przedstawiono w poniższych tabelach:

Zawartość zestawu LC-MS na 100 próbek:

Zawartość zestawu GC-MS na 100 próbek:

Opis

Nasze zestawy MetAmino ^® LC-MS i GC-MS zapewniają szybką, niezawodną, powtarzalną i dokładną procedurę analizy aminokwasów, która obejmuje zarówno przygotowanie próbki, jak i rozdział chromatograficzny.

Metoda LC-MS opiera się na mikroekstrakcji do fazy stałej przy użyciu specjalnych filtrów mikrospinowych ( MSPE ) z nowo opracowanym sorbentem i zintegrowaną membraną 0,22 µm, metoda GC-MS wykorzystuje mikroekstrakcję ciecz-ciecz ( LLME ) do przygotowania. Po tej wstępnej obróbce próbkę analizuje się w LC-MS (GC-MS). W sumie przygotowanie próbki do LC-MS zajmuje około 8 minut, a analiza próbki 12 minut, więc cały czas trwania eksperymentu wynosi tylko 20 minut. Całkowity czas eksperymentu GC-MS jest jeszcze krótszy – około 17 minut.

Ten unikalny zestaw spełnia wszystkie wymagania laboratoryjne i jest przeznaczony dla wszystkich użytkowników końcowych poszukujących prostej metody analitycznej i wysokiej wydajności separacji.

Często zadawane pytania dotyczące MetAmino

Jaki jest rodzaj membrany wewnątrz filtra wirowego?

• Membrana wykonana jest z materiału NYLON, a jej porowatość wynosi 0,22 µm. Jego średnica jest zoptymalizowana do użytku z danym filtrem obrotowym.

Czy istnieje możliwość rozbudowy zestawu ^MetAmino® o inne anality?

• Tak, zestaw MetAmino ^® można dalej rozbudowywać. Skontaktuj się z nami w celu uzyskania szczegółowych informacji.

Czy mogę używać zestawu MetAmino ^® do badania moczu?

• Tak, zestaw MetAmino ^® może być używany do analizy moczu. Próbka nie może zawierać białek, dlatego przed użyciem zestawu należy ją potraktować w zwykły sposób (wirowanie, filtracja).

Czy możemy zamówić odczynniki osobno?

• Tak, cały zestaw odczynników można zamówić pod numerem katalogowym MAK-5857-L002 .

Jakie jest ciśnienie podczas analizy LC/MS?

• Na początku analizy ciśnienie wynosi 380 barów, na końcu 200 barów.

Czy MRM dla aminokwasów wymienionych w zestawie MetAmino ^® są generowane po czy przed derywatyzacją standardów?

• Przejścia MRM dla AA wymienione w podręczniku są wymienione jako przejścia pochodnych AA, a nie natywne AA.

Czy próbkę paszy należy poddać hydrolizie przed użyciem zestawu MetAmino ^® ?

• Wytrącanie przy użyciu ośrodka wytrącającego (PM) nie jest niezbędnym krokiem do udanej derywatyzacji próbki. Zestaw został przetestowany przede wszystkim pod kątem analizy biopłynów, które często zawierają peptydy. Aby zapobiec ich wytrącaniu podczas derywatyzacji, w protokole przygotowania próbki uwzględniono etap wytrącania.
• Jeśli wymagana jest całkowita analiza wolnych i związanych z peptydami aminokwasów, w takim przypadku zalecamy zhydrolizowanie próbki, a następnie wysuszenie części zhydrolizowanej próbki w strumieniu azotu lub w speedvacu. Rozpuść wysuszoną pozostałość w 25 µl dejonizowanej wody lub 0,1 M wodnym roztworze HCl (dla lepszej rozpuszczalności) i postępuj zgodnie z zaleceniami, dodając 10 µl roztworu IS.
• Jeśli chodzi o hydrolizę peptydów, stosowane dodatki (fenol, tiodiglikol) w pożywce do hydrolizy mogą być również derywatyzowane (prawdopodobnie niewidoczne w „ pełnym skanie ”). Dlatego jako medium do hydrolizy zalecamy 6M HCl.

Czy możemy zamówić zestaw MetAmino ^® GC/MS do przygotowania 400 próbek?

• Jeszcze nie, aktualnie posiadamy tylko zestaw MetAmino ^® GC/MS do przygotowania 100 próbek. Zestaw ten można zamówić pod numerem katalogowym MAK-5857-BA01.

W tabeli znajduje się 78 aminokwasów, z których część nie znajduje się w dostępnych standardowych mieszankach - więc czy powinniśmy polegać na przejściach MRM i patrzeć na czas retencji, czy też są to standardy, które powinniśmy kupić, jeśli chcemy je oznaczyć?

• Dla celów ilościowych zestaw MetAmino zawiera - jedna fiolka roztworu wzorcowego SD1 zawarta w zestawie zawiera 33 aminokwasy: AAA, ABA, ALA, APA, ARG, ASP, BAIBA, CC, CIT, CTH, GABA, GLU, GLY , GPR , HIS, HLY , HYP, ILE, LEU, LYS, MET, 1MHIS, 3MHIS, ORN, PHE, PHP, PRO, SAR, SER, THR, TPR, TYR, VAL i SD2 fiolka z liofilizowaną mieszaniną 3 aminokwasów : ASN, GLN, TRP. Jednak zestaw aminokwasów można dalej rozszerzyć na inne związki zawierające pierwszorzędowe lub drugorzędowe aminowe grupy funkcyjne.
• Masy (m/z) podane w instrukcji są prawidłowe i reprezentują jony M+H+. Masy (m/z) i czasy retencji z instrukcji uzyskano z instrumentu liniowej pułapki jonowej LTQ, ale dane z Certyfikatu Analizy uzyskano z instrumentu Q Exactive plus HRMS. W obu przypadkach zastosowano tę samą kolumnę, natężenie przepływu i skład fazy ruchomej. Czasy retencji (RT) są wartościami doświadczalnymi, a rozbieżności, szczególnie w przypadku późno eluujących związków, byłyby spowodowane użyciem różnych przyrządów LC/MS.