przygotowanie próbki

Po wyodrębnieniu zawartości z matrycy można przystąpić do przygotowania próbki do analizy LC-MS/GC-MS.

Protokół ten jedynie w skrócie opisuje procedurę przygotowania próbki. Szczegółową procedurę można znaleźć w instrukcji obsługi Metamino^®.

Analiza LC-MS przebiega w następujący sposób:

1. Odpipetuj 100 μl wyekstrahowanej zawartości (surowicy, osocza, ...) i dodaj 100 μl podłoża wytrącającego. Wiruj przez 30 do 60 sekund przy 1500 g (6000 obr/min).
2. Odpipetuj 25 µl wytrąconej próbki i dodaj 10 µl roztworu wzorca wewnętrznego do każdej fiolki do przygotowania próbki.
3. Odpipetuj 25 μl roztworu katalizatora do każdej fiolki do przygotowania próbki i wiruj przez 5-10 sekund.
4. Odpipetuj 10 μl roztworu odczynnika do każdej fiolki do przygotowania próbki i wiruj przez 5-10 sekund. Pozwól, aby derywatyzacja przebiegała przez co najmniej 2-3 minuty.
5. Aktywuj i zrównoważ sorbent w filtrze mikrowirowym dodając:
   1. 200 µl podłoża aktywacyjnego MSPE, następnie wirować przez 30 do 60 sekund przy 1500 g (6000 obr/min).
   2. 200 µl podłoża do równoważenia sorbentu MSPE, następnie wirować przez 30 do 60 sekund przy 1500 g (6000 obr/min).
6. Wylać płyn przez membranę.
7. Rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną derywatyzacji 400 µl środka do rozcieńczania i przemywania i wirować przez 5-10 sek.
8. Nałożyć rozcieńczoną mieszaninę reakcyjną (zwykle 450-500 µl) na zwilżony sorbent z filtrem mikrowirowym i odstawić na 1-2 minuty. Wiruj przez 30 do 60 sekund przy 1500 g (6000 obr/min).
9. Wylać płyn przez membranę.
10. Przemyć sorbent w filtrze mikrowirówkowym 200 µl rozcieńczenia i medium płuczącego, a następnie wirować przez 30 do 60 sekund przy 1500 g (6000 obr/min).
11. Umieścić filtr mikrowirówkowy w nowej fiolce wirówkowej, dodać 200 µl medium elucyjnego i wirować przez 30 do 60 sekund przy 1500 g (6000 obr/min).
12. Przenieść eluat do fiolki autosamplera. Próbka jest gotowa do analizy LC-MS.

Analiza GC-MS przebiega w następujący sposób:

1. Odpipetować 25 µl próbki docelowej i 10 µl roztworu wzorca wewnętrznego do każdej szklanej probówki reakcyjnej.
2. Odpipetować 20 µl środka redukującego do każdej szklanej probówki reakcyjnej i krótko wstrząsać przez 5 do 10 sekund. Odstaw na 1 do 2 minut.
3. Odpipetować 25 µl podłoża podstawowego do każdej szklanej probówki reakcyjnej i dodać 50 µl roztworu odczynnika (derywatyzacji) do każdej szklanej probówki reakcyjnej i wirować przez 5 do 10 sekund.
4. Odpipetować 25 µl roztworu katalizatora do każdej fiolki do przygotowania próbki i wirować przez 5 do 10 sekund.
5. Odpipetować 25 µl roztworu katalizatora do każdej fiolki do przygotowania próbki i wirować przez 5 do 10 sekund. Odstaw na 1-2 minuty. Emulsję stopniowo dzieli się na dwie warstwy.
6. Odpipetuj 50 μl ośrodka ekstrakcyjnego do każdej fiolki do przygotowania próbki i wiruj przez 5 do 10 sekund.
7. Odpipetuj 25 μl kwaśnego podłoża do każdej fiolki do przygotowania próbki i wiruj przez 5 do 10 sekund. Następnie wiruj przez 30 do 60 sekund przy 1500 g (6000 obr/min).
8. Przenieść warstwę organiczną (górną) (50-100 µl) do fiolki autosamplera z wkładką. Próbkę przygotowuje się do analizy GC-MS.