Chromatografia

Voľba kapilár pre rôzne prietoky

ID	Prietok	Farba	OD
0,13 mm	Až 2,0 ml/min	Červené	1/16"
0,18 mm	Až 5,0 ml/min	Žltá	1/16"
0,25 mm	Až 20 ml/min	Modrý	1/16"
0,50 mm	Až 50 ml/min	oranžový	1/16"
0,75 mm	Až 100 ml/min	Zelená	1/16"
1,0 mm	Až 200 ml/min	Šedá	1/16"
1,59 mm	Až 500 ml/min		1/8"".
2,40 mm	Až 1000 ml/min		1/8"".

Palce na mm – palec x 25,4 = mm

Stopy na meter – stopy x 0,3048 = meter

Tlak na kolóne pri prietoku 1 ml/min

P = 2,1 xdx 10,13 xh /h ² x vp ²

P – tlak (MPa)
L – dĺžka kolóny v mm
h - dynamická viskozita (pre vodu = 1)
d – vnútorný priemer kolóny v mm
vp – veľkosť častíc v µm

Tlak na kolóne 4,6 x 250 mm, 5 um bude pri prietoku 1,0 ml/min cca 100 bar

Voľba kolóny v závislosti od veľkosti nástreku a jej kapacity

ID (mm)	Hodnota nástreku (µl)	Kapacita kolóny (mg)	Prietok (ml/min)
4,6	5-100	1	0,5 – 2,0
10	100–1000	5	4,0 – 15,0
21,2	1000 – 5000	20	10 – 50
30	2000 – 10 000	40	40 – 100
50	5000 – 20 000	120	100–300
100	10 000 – 50 000	500	400–1000

pK kyselín a zásad používaných ako aditívum pre mobilné fázy HPLC

pK _a kyslých a zásaditých pufrov v HPLC na prípravu mobilnej fázy

Kyslý pufer	Teplota (°C)	pK ₁	pK ₂		pK ₃
ACES 2-[(2-amino-2-oxoetyl)amino]etansulfónová kyselina	20	6.9	-		-
Octová kyselina	25	4.8	-		-
Kyselina boritá	20	9.1	12.7		13.8
CAPS 3-(cyklohexylamino)ethansulfónová kyselina	20	10.4	-		-
Kyselina citrónová	25	3.1	4.8		6.4
Kyselina mravčia	20	3.8	-		-
Glycín	25	2.3	9.6		-
Glycylglycín	20	8.4	-		-
HEPES N-2-hydroxyetylpiperazín-N'-2-ethansulfónová kyselina	20	7.6	-		-
Imidazol	20	7,0	-		-
MES 2-(N-morfolino)ethansulfónová kyselina	20	6.2	-		-
MOPS 3-(N-morfolino)propansulfónová kyselina	20	7.2	-		-
Kyselina šťaveľová	25	1.3	4.3		-
Kyselina fosforečná	25	2.1	7.2		12.7
TES 2-[tris(hydroxymetyl)metyl]aminoethansulfónová kyselina	20	7.5	-		-
Kyselina trifluoroctová	25	0,3	-		-
Tricín N-[tris(hydroxymetyl)metyl]glycín	20	8.2	-		-
TRIS Tris(hydroxylmetyl)aminometán	20	8.3	-		-
_pKb báz pri HPLC na prípravu mobilnej fázy
Zásaditý pufer	teplota (°C)	pK ₁	pK ₂	pK ₃
Amoniak	25	9.3	-	-
Dietylamín	20	11.1	-	-
dimethylamín	25	10.7	-	-
Etylamín	20	10.8	-	-
Etylendiamín	20	10.1	7,0	-
metylamín	25	10.7	-	-
Morfólín	25	8.3	-	-
trietylamín (TEA)	18	11.0	-	-
trimetylamín	25	9.8	-	-

Pozn: Rozmedzie pH, pre ktoré je vhodný vhodný je v rozsahu pK ± 1. Je potrebné vziať do úvahy UV Cutoff použitého pufra (tab. 2)

Aplikace a podpora v UHPLC

Chronometr Přenos metody (z konvenční HPLC do UHPLC)

Kapacita vzorků (jak ovlivní menší částice kapacitu vzorků?)

Přenos metod z klasické HPLC do UHPLC vyžaduje nejprve optimalizaci selektivity a účinnosti kolony pro požadovanou aplikaci. Jakmile je tato část vývoje metody hotová, můžeme přistoupit k přenosu metody do UHPLC. K tomu nám poslouží několik jedhoduchých výpočtů, které pomohou stanovit ekvivalentní podmínky separace. Tento článek je postupně popisuje.

Volba délky kolony

První výpočet stanovuje vhodnou délku chromatografické kolony. Při zachování délky kolony a snižování velikosti částic se zvýší počet teoretických pater dané kolony. Proto můžeme kolonu zkrátit aniž bychom ztratili rozlišení. Použitím vzorce 1 a volbou vhodné délky kolony docílíme zachování stejné separace jako u knovenční HPLC.

Optimalizace nástřikového objemu

Jakmile jsme stanovili vhodnou délku kolony, můžeme optimalizovat objem nástřiku. Snižováním vnitřního průměru a délky kolony se sníží její celkový objem a kapacita vzorku. Proto musíme upravit nástřikový objem podle vzorce 2. Zde je nutné si uvědomit, že díky snížení celkového objemu kolony je velice důležité, aby byla zajištěna kompatibilita rozpouštědla vzorku se složením mobilní fáze. V opačném případě dojde k nereprodukovatelnosti retenčních časů, účinnosti a dokonce může dojít ke změně selektivity.

Nastavení průtoku

Průtok je nutné nastavit tak, aby byla u menší kolony zajištěna vhodná lineární rychlost. Ta je definována jako vzdálenost, kterou dosáhne mobilní fáze za časovou jednotku (na rozdíl od průtoku, který je definován jako objem mobilní fáze, který prochází chromatografickou kolonou za čas). Abychom zachovali stejnou lineární rychlost, která je důležitá pro zachování účinnosti, musí být průtok mobilní fáze snížen se zmenšením průměru kolony. U izokratické separace lze průtok kolonou vypočítat podle vzorce 3 (nutno vzít v úvahu i velikost částic). Tím bychom měli snadno a rychle odhadnout nastavení průtoku pro ekvivalentní chromatografii. Zde je důležité si uvědomit, že částice s velikostí pod 2µm jsou méně ovlivňovány při vyšších průtocích a proto mohou být použity vyšší průtoky v izokratických separacích bez škodlivých účinků na účinnost separace.

Nastavení časového programu

Na závěr, po optimalizaci délky kolony, nástřikového objemu a průtoku, můžeme přistoupit k nastavení začátku gradientu. Při přenosu metody z konvenční HPLC do UHPLC musíme upravit počátek gradientu tak, aby docházelo k interakcím fáze ve stejnou dobu. Tu nastavíme pomocí vzorce 4.

Literatura: Rick Lake, Restek Corporation

Vizkozita rozpouštědel

Závislost viskozity směsí rozpouštědel na jejích procentuálním složení

% vody	viskozita (MeOH/voda)	viskozita (AcCN/voda)
0	0.65	0.35
10	0.95	0.50
20	1.20	0.55
30	1.60	0.70
40	1.75	0.80
50	1.90	0.90
60	1.80	1.00
70	1.75	1.05
80	1.65	1.10
90	1.40	1.05
100	1.00	1.00

Tabulky pro chromatografii

Volba kapiláry pro různé průtoky

Výběr kolony v závislosti na velikosti nástřiku a kapacitě kolony

UV cutoff aditiv mobilních fází

pK_a kyselých pufrů v mobilních fázích pro HPLC

pK_b bází v mobilních fázích pro HPLC

Přepočty jednotek tlaku

Odhad tlaku na kolonách v závislosti na velikosti částic, průměru a délce kolony

Viskozity směsí rozpouštědel

Vlastnosti rozpouštědel

Carbotrap X

Parameter	Characteristika
Síla/typ adsorbentu	středně silný sorbent na bázi černého uhlí
Měrný povrch	cca. 240 m²/g
Přibližný rozsah těkavosti	n-C_3/4 až n-C_6/7 (b.v. 50 až 150°C)
Příklady analytů	lehké uhlovodíky, 1,3-butadien, benzen (pro 2-týdenní dufúzní vzorkování)
Maximální teplota adsorbentu	> 400°C
Doporučená teplota kondicionování	350 až 400°C
Doporučená desorpční teplota	350 až 400°C (pod teplotou kondicionování)

Další informace

hydrofóbní
minimální obsah vlastních artefaktů (<0.1 ng)
stopové kovy pocházející z výroby způsobují aktivititu sorbentu
drolivý - při mechanickém šoku snadno vytváří jemné částečky. Vyvarujte se nárazům sorpčních trubiček obsahujících tento sorbent.
stlačitelný - přeplnění může způsobit vyšší odpor a ovlivnit průtok odběrového čerpadla
doporučená zrnitost sorpčních trubiček a "cold trapu" činí 40/60 mesh
doporučená obnova sorbentu po 200 tepelných cyklech

Carbopack X

Parameter	Characteristika
Síla/typ adsorbentu	středně silný sorbent na bázi černého uhlí
Měrný povrch	cca. 240 m²/g
Přibližný rozsah těkavosti	n-C_3/4 až n-C_6/7 (b.v. 50 až 150°C)
Příklady analytů	lehké uhlovodíky, 1,3-butadien, benzen (pro 2-týdenní dufúzní vzorkování)
Maximální teplota adsorbentu	> 400°C
Doporučená teplota kondicionování	350 až 400°C
Doporučená desorpční teplota	350 až 400°C (pod teplotou kondicionování)

Další informace

hydrofóbní
minimální obsah vlastních artefaktů (<0.1 ng)
stopové kovy pocházející z výroby způsobují aktivititu sorbentu
drolivý - při mechanickém šoku snadno vytváří jemné částečky. Vyvarujte se nárazům sorpčních trubiček obsahujících tento sorbent.
stlačitelný - přeplnění může způsobit vyšší odpor a ovlivnit průtok odběrového čerpadla
doporučená zrnitost sorpčních trubiček a "cold trapu" činí 40/60 mesh
doporučená obnova sorbentu po 200 tepelných cyklech

Tenax GR

Parameter	Characteristika
Síla/typ adsorbentu	slabý porézní polymer
Měrný povrch	cca. 35 m²/g
Přibližný rozsah těkavosti	n-C₇ až n-C₃₀ (b.v. 100 až 450°C)
Příklady analytů	aromatické sloučeniny (vyjma benzenu), nepolární sloučeniny s b.v. > 100°C, polární sloučeniny s b.v. > 150°C, PAH, PCB
Maximální teplota adsorbentu	350°C
Doporučená teplota kondicionování	do 325°C
Doporučená desorpční teplota	do 300°C

Další informace

hydrofóbní
malý obsah vlastních artefaktů (<1 ng)
inertní - vhodný pro nestabilní sloučeniny
Tenax GR (grafitická forma) je nejvhodnější pro PAH a PCB
účinná desorpce
maximální teplota sorbentu nesmí být překročena, protože by došlo k rozkladu sorbentu a jeho vypařování a tím by mohlo dojít ke kontaminaci plynových cest
doporučená zrnitost sorpčních trubiček a "cold trapu" činí 35/60 mesh
doporučená obnova sorbentu po 100 tepelných cyklech