Chromatografie

Volba kapilár pro různé průtoky

ID	Průtok	Barva	OD
0,13 mm	Až 2,0 ml/min	Červené	1/16"
0,18 mm	Až 5,0 ml/min	Žlutá	1/16"
0,25 mm	Až 20 ml/min	Modrý	1/16"
0,50 mm	Až 50 ml/min	oranžový	1/16"
0,75 mm	Až 100 ml/min	Zelená	1/16"
1,0 mm	Až 200 ml/min	Šedá	1/16"
1,59 mm	Až 500 ml/min		1/8"".
2,40 mm	Až 1000 ml/min		1/8"".

Palce na mm – palec x 25,4 = mm

Stopy na metr – stopy x 0,3048 = metr

Tlak na koloně při průtoku 1 ml/min

P = 2,1 x d x 10,13 x h / h ² x vp ²

P – tlak (MPa)
L – délka kolony v mm
h - dynamická viskozita (pro vodu = 1)
d – vnitřní průměr kolony v mm
vp – velikost částic v µm

Tlak na koloně 4,6 x 250 mm, 5 um bude při průtoku 1,0 ml/min cca 100 bar

Volba kolony v závislosti na velikosti nástřiku a její kapacitě

ID (mm)	Hodnota nástřiku (µl)	Kapacita kolony (mg)	Průtok (ml/min)
4,6	5-100	1	0,5 – 2,0
10	100–1000	5	4,0 – 15,0
21,2	1000–5000	20	10 – 50
30	2000 – 10 000	40	40 – 100
50	5000 – 20 000	120	100–300
100	10 000 – 50 000	500	400–1000

pK kyselin a zásad používaných jako aditivum pro mobilní fáze HPLC

pK_a kyselých a zásaditých pufrů v HPLC pro přípravu mobilní fáze

Kyselý pufr	Teplota (°C)	pK ₁	pK ₂		pK ₃
ACES 2-[(2-amino-2-oxoethyl)amino]ethansulfonová kyselina	20	6.9	-		-
Octová kyselina	25	4.8	-		-
Kyselina boritá	20	9.1	12.7		13.8
CAPS 3-(cyklohexylamino)ethansulfonová kyselina	20	10.4	-		-
Kyselina citronová	25	3.1	4.8		6.4
Kyselina mravenčí	20	3.8	-		-
Glycin	25	2.3	9.6		-
Glycylglycin	20	8.4	-		-
HEPES N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonová kyselina	20	7.6	-		-
Imidazol	20	7,0	-		-
MES 2-(N-morfolino)ethansulfonová kyselina	20	6.2	-		-
MOPS 3-(N-morfolino)propansulfonová kyselina	20	7.2	-		-
Kyselina šťavelová	25	1.3	4.3		-
Kyselina fosforečná	25	2.1	7.2		12.7
TES 2-[tris(hydroxymethyl)methyl]aminoethansulfonová kyselina	20	7.5	-		-
Kyselina trifluoroctová	25	0,3	-		-
Tricin N-[tris(hydroxymethyl)methyl]glycin	20	8.2	-		-
TRIS Tris(hydroxylmethyl)aminomethan	20	8.3	-		-
_pKb bází při HPLC pro přípravu mobilní fáze
Zásaditý pufr	teplota (°C)	pK ₁	pK ₂	pK ₃
Amoniak	25	9.3	-	-
Diethylamin	20	11.1	-	-
dimethylamin	25	10.7	-	-
Ethylamin	20	10.8	-	-
Ethylendiamin	20	10.1	7,0	-
methylamin	25	10.7	-	-
Morfolin	25	8.3	-	-
triethylamin (TEA)	18	11.0	-	-
trimethylamin	25	9.8	-	-

Pozn: Rozmezí pH, pro které je vhodný vhodný je v rozsahu pK ± 1. Je třeba vzít v úvahu UV Cutoff použitého pufru (tab. 2)

Aplikace a podpora v UHPLC

Chronometr Přenos metody (z konvenční HPLC do UHPLC)

Kapacita vzorků (jak ovlivní menší částice kapacitu vzorků?)

Přenos metod z klasické HPLC do UHPLC vyžaduje nejprve optimalizaci selektivity a účinnosti kolony pro požadovanou aplikaci. Jakmile je tato část vývoje metody hotová, můžeme přistoupit k přenosu metody do UHPLC. K tomu nám poslouží několik jedhoduchých výpočtů, které pomohou stanovit ekvivalentní podmínky separace. Tento článek je postupně popisuje.

Volba délky kolony

První výpočet stanovuje vhodnou délku chromatografické kolony. Při zachování délky kolony a snižování velikosti částic se zvýší počet teoretických pater dané kolony. Proto můžeme kolonu zkrátit aniž bychom ztratili rozlišení. Použitím vzorce 1 a volbou vhodné délky kolony docílíme zachování stejné separace jako u knovenční HPLC.

Optimalizace nástřikového objemu

Jakmile jsme stanovili vhodnou délku kolony, můžeme optimalizovat objem nástřiku. Snižováním vnitřního průměru a délky kolony se sníží její celkový objem a kapacita vzorku. Proto musíme upravit nástřikový objem podle vzorce 2. Zde je nutné si uvědomit, že díky snížení celkového objemu kolony je velice důležité, aby byla zajištěna kompatibilita rozpouštědla vzorku se složením mobilní fáze. V opačném případě dojde k nereprodukovatelnosti retenčních časů, účinnosti a dokonce může dojít ke změně selektivity.

Nastavení průtoku

Průtok je nutné nastavit tak, aby byla u menší kolony zajištěna vhodná lineární rychlost. Ta je definována jako vzdálenost, kterou dosáhne mobilní fáze za časovou jednotku (na rozdíl od průtoku, který je definován jako objem mobilní fáze, který prochází chromatografickou kolonou za čas). Abychom zachovali stejnou lineární rychlost, která je důležitá pro zachování účinnosti, musí být průtok mobilní fáze snížen se zmenšením průměru kolony. U izokratické separace lze průtok kolonou vypočítat podle vzorce 3 (nutno vzít v úvahu i velikost částic). Tím bychom měli snadno a rychle odhadnout nastavení průtoku pro ekvivalentní chromatografii. Zde je důležité si uvědomit, že částice s velikostí pod 2µm jsou méně ovlivňovány při vyšších průtocích a proto mohou být použity vyšší průtoky v izokratických separacích bez škodlivých účinků na účinnost separace.

Nastavení časového programu

Na závěr, po optimalizaci délky kolony, nástřikového objemu a průtoku, můžeme přistoupit k nastavení začátku gradientu. Při přenosu metody z konvenční HPLC do UHPLC musíme upravit počátek gradientu tak, aby docházelo k interakcím fáze ve stejnou dobu. Tu nastavíme pomocí vzorce 4.

Literatura: Rick Lake, Restek Corporation

Vizkozita rozpouštědel

Závislost viskozity směsí rozpouštědel na jejích procentuálním složení

% vody	viskozita (MeOH/voda)	viskozita (AcCN/voda)
0	0.65	0.35
10	0.95	0.50
20	1.20	0.55
30	1.60	0.70
40	1.75	0.80
50	1.90	0.90
60	1.80	1.00
70	1.75	1.05
80	1.65	1.10
90	1.40	1.05
100	1.00	1.00

Tabulky pro chromatografii

Volba kapiláry pro různé průtoky

Výběr kolony v závislosti na velikosti nástřiku a kapacitě kolony

UV cutoff aditiv mobilních fází

pK_a kyselých pufrů v mobilních fázích pro HPLC

pK_b bází v mobilních fázích pro HPLC

Přepočty jednotek tlaku

Odhad tlaku na kolonách v závislosti na velikosti částic, průměru a délce kolony

Viskozity směsí rozpouštědel

Vlastnosti rozpouštědel

Carbotrap X

Parameter	Characteristika
Síla/typ adsorbentu	středně silný sorbent na bázi černého uhlí
Měrný povrch	cca. 240 m²/g
Přibližný rozsah těkavosti	n-C_3/4 až n-C_6/7 (b.v. 50 až 150°C)
Příklady analytů	lehké uhlovodíky, 1,3-butadien, benzen (pro 2-týdenní dufúzní vzorkování)
Maximální teplota adsorbentu	> 400°C
Doporučená teplota kondicionování	350 až 400°C
Doporučená desorpční teplota	350 až 400°C (pod teplotou kondicionování)

Další informace

hydrofóbní
minimální obsah vlastních artefaktů (<0.1 ng)
stopové kovy pocházející z výroby způsobují aktivititu sorbentu
drolivý - při mechanickém šoku snadno vytváří jemné částečky. Vyvarujte se nárazům sorpčních trubiček obsahujících tento sorbent.
stlačitelný - přeplnění může způsobit vyšší odpor a ovlivnit průtok odběrového čerpadla
doporučená zrnitost sorpčních trubiček a "cold trapu" činí 40/60 mesh
doporučená obnova sorbentu po 200 tepelných cyklech

Carbopack X

Parameter	Characteristika
Síla/typ adsorbentu	středně silný sorbent na bázi černého uhlí
Měrný povrch	cca. 240 m²/g
Přibližný rozsah těkavosti	n-C_3/4 až n-C_6/7 (b.v. 50 až 150°C)
Příklady analytů	lehké uhlovodíky, 1,3-butadien, benzen (pro 2-týdenní dufúzní vzorkování)
Maximální teplota adsorbentu	> 400°C
Doporučená teplota kondicionování	350 až 400°C
Doporučená desorpční teplota	350 až 400°C (pod teplotou kondicionování)

Další informace

hydrofóbní
minimální obsah vlastních artefaktů (<0.1 ng)
stopové kovy pocházející z výroby způsobují aktivititu sorbentu
drolivý - při mechanickém šoku snadno vytváří jemné částečky. Vyvarujte se nárazům sorpčních trubiček obsahujících tento sorbent.
stlačitelný - přeplnění může způsobit vyšší odpor a ovlivnit průtok odběrového čerpadla
doporučená zrnitost sorpčních trubiček a "cold trapu" činí 40/60 mesh
doporučená obnova sorbentu po 200 tepelných cyklech

Tenax GR

Parameter	Characteristika
Síla/typ adsorbentu	slabý porézní polymer
Měrný povrch	cca. 35 m²/g
Přibližný rozsah těkavosti	n-C₇ až n-C₃₀ (b.v. 100 až 450°C)
Příklady analytů	aromatické sloučeniny (vyjma benzenu), nepolární sloučeniny s b.v. > 100°C, polární sloučeniny s b.v. > 150°C, PAH, PCB
Maximální teplota adsorbentu	350°C
Doporučená teplota kondicionování	do 325°C
Doporučená desorpční teplota	do 300°C

Další informace

hydrofóbní
malý obsah vlastních artefaktů (<1 ng)
inertní - vhodný pro nestabilní sloučeniny
Tenax GR (grafitická forma) je nejvhodnější pro PAH a PCB
účinná desorpce
maximální teplota sorbentu nesmí být překročena, protože by došlo k rozkladu sorbentu a jeho vypařování a tím by mohlo dojít ke kontaminaci plynových cest
doporučená zrnitost sorpčních trubiček a "cold trapu" činí 35/60 mesh
doporučená obnova sorbentu po 100 tepelných cyklech