HPLC závady a jejich odstranění

Abnormální tlak

Žádné čtení tlaku, žádný průtok

Možná příčina	Řešení
Vypnout	Zapněte napájení
Spálená pojistka	Vyměňte pojistku
Nastavení nebo porucha ovladače	Ověřte správná nastavení, opravte nebo vyměňte ovladač
Zlomený píst	Vyměňte píst
Vzduch zachycený v hlavě čerpadla	Odplyněte mobilní fázi, vypusťte vzduch z čerpadla a naplňte čerpadlo
Nedostatečná mobilní fáze	Doplňte zásobník, vyměňte vstupní fritu, pokud je ucpaná
Vadné zpětné ventily	Vyměňte zpětné ventily
Velký únik	Utáhněte nebo vyměňte armatury

Nyní odečteme tlak, průtok je normální

Možná příčina	Řešení
Vadný měřič	Vyměňte měřič
Vadný převodník tlaku	Vyměňte převodník

Vysoký protitlak

Možná příčina	Řešení
Průtok je nastaven příliš vysoko	Upravte nastavení
Zablokovaná sloupcová frita	Proveďte zpětné propláchnutí kolony, pokud je to povoleno, vyměňte fritu podle pokynů výrobce a záručních podmínek nebo kolonu vyměňte
Nesprávná mobilní fáze, vysrážený pufr	Použijte správnou mobilní fázi, promyjte kolonu
Nevhodný sloupec	Použijte správný sloupec
Zablokování vstřikovače	Odstraňte ucpání nebo vyměňte vstřikovač
Teplota kolony je příliš nízká	Zvyšte teplotu
Porucha ovladače	Opravte nebo vyměňte ovladač
Zablokovaný ochranný sloup	Odstraňte/vyměňte ochranný sloup
Blokovaný in-line filtr	Vyjměte/vyměňte in-line filtr

Měli byste zjistit, co způsobilo vysoký protitlak - sloupec nebo systém? Doporučujeme následující postup:

Vyjměte kolonu ze systému a zapněte čerpadlo. Pokud se stále objevuje vysoký protitlak, pak je zablokování v systému:

• ucpané nebo zvlněné potrubí
• špinavá frita čerpadla
• nebo ucpaný vstřikovací ventil

Pokud je tlak normální, je problém se sloupcem:

• ucpaný nebo poškozený předkolonový filtr, ochranná kolona nebo frita
• precipitace vzorku nebo pufru v koloně

Nízký protitlak

Možná příčina	Řešení
Průtok je nastaven příliš nízko	Upravte průtok
Únik v systému	Najděte a opravte
Nevhodný sloupec	Použijte správný sloupec
Teplota kolony je příliš vysoká	Nižší teplota
Porucha ovladače	Opravte nebo vyměňte ovladač

Kolísavý tlak

Viz část Vysoký protitlak .

Tlak klesá na nulu

Viz části Žádný odečet tlaku, žádný průtok a Žádný odečet tlaku, průtok je normální

Tlak klesá, ale ne na nulu

Viz část Nízký tlak

Cyklování tlaku

Možný případ	Řešení
Vzduch v čerpadle	Odplyněte rozpouštědlo a/nebo vypusťte vzduch z čerpadla
Vadný zpětný ventil(y)	Vyměňte zpětný ventil(y)
Selhání těsnění čerpadla	Vyměňte těsnění čerpadla
Nedostatečné odplynění	Odplyněte rozpouštědlo a/nebo změňte metody odplynění (např. použijte vakuový odplyňovač)
Únik v systému	Najděte netěsnost a opravte ji
Použití gradientové eluce	Cyklování tlaku je normální kvůli změně viskozity

---

Netěsnosti

Úniky se obvykle zastaví dotažením nebo výměnou armatury. Uvědomte si však, že příliš utažené kovové svěrné spojky mohou prosakovat a plastové spojky se mohou opotřebovat. Pokud se netěsnost armatury nezastaví ani po mírném utažení armatury, rozeberte armaturu a zkontrolujte, zda není poškozená (např. zdeformovaný kroužek nebo částice na těsnicí ploše). Pokud je armatura nebo objímka poškozena, vyměňte ji za novou.

Netěsné armatury

Možná příčina	Řešení
Volné kování	Utáhněte armaturu
Odizolovaná armatura	Vyměňte armaturu
Příliš utažené kování	Uvolněte a znovu utáhněte armaturu. Pokud je armatura poškozena, vyměňte ji.
Špinavá armatura	Demontujte armaturu a vyčistěte ji. Pokud je armatura poškozena, vyměňte ji.
Neodpovídající díly	Používejte všechny díly stejné značky/typu.

Netěsnosti na čerpadle

Možná příčina	Řešení
Uvolněné zpětné ventily	Utáhněte zpětný ventil (nepřetahujte) nebo vyměňte zpětný ventil
Volné kování	Utáhněte armatury (neutahujte příliš)
Porucha těsnění směšovače	Opravte nebo vyměňte
Selhání těsnění čerpadla	Opravte nebo vyměňte těsnění
Selhání tlumiče impulsů	Vyměňte tlumič pulzů
Porucha proporcionálního ventilu	Zkontrolujte membrány, vyměňte je, pokud jsou netěsné a/nebo zkontrolujte, zda nejsou poškozené, vyměňte je
Vypouštěcí ventil	Utáhněte ventil nebo jej vyměňte, pokud je vadný

Netěsnosti vstřikovače

Možná příčina	Řešení
Selhání těsnění rotoru	Přestavte nebo vyměňte rotor
Blokovaná smyčka	Vyčistěte nebo vyměňte smyčku
Uvolněné těsnění portu vstřikovače	Upravit
Nesprávný průměr jehly injekční stříkačky	Použijte správnou injekční stříkačku
Odpadní potrubí sifonování	Odpadní vedení udržujte nad povrchem rozlehlé, se správným sklonem
Zablokování odpadního potrubí	Vyměňte odpadní vedení

Kolona netěsní

Možná příčina	Řešení
Volné zakončení	Utáhněte koncovku
Těsnění sloupu v objímce	Demontujte, opláchněte objímku, znovu složte
Nesprávná tloušťka frity	Použijte správnou fritu (*)

*Poznámka: Pokud je velikost částic stacionární fáze 3 až 4 µm, použijte fritu 0,5 µm. Pokud je velikost částic stacionární fáze 5 až 20 µm, použijte fritu 2 µm.

Netěsnosti detektoru

Možná příčina	Řešení
Selhání těsnění článku	Zabraňte nadměrnému zpětnému tlaku nebo vyměňte těsnění
Prasklé okno(a) buňky	Nahradit okna buněk
Netěsné armatury	Utáhněte nebo vyměňte armatury
Ucpané odpadní vedení	Vyměňte odpadní vedení
Blokujte průtokovou buňku	Přestavte nebo vyměňte průtokovou celu

---

Problémy s chromatogramem

Mnoho problémů v systému LC se projevuje jako změny v chromatogramu. Některé z nich lze vyřešit změnami v přístroji, jiné problémy však vyžadují úpravu postupu stanovení. Nastavení správného typu kolony, předkolony nebo ochranné kolony, hadiček, detekční cely a mobilní fáze jsou klíčem k dobré chromatografii .

Špičková hlušina

Možná příčina	Řešení
Zablokovaná frita	Vraťte proplach kolony (pokud je to povoleno) nebo vyměňte fritu (pokud je to povoleno) nebo kolonu vyměňte
Sloupec je prázdný	Vyplnit prázdnotu
Rušivý vrchol	Použijte delší kolonu nebo změňte mobilní fázi a/nebo selektivitu kolony
Nesprávné pH mobilní fáze	Upravte pH. U bazických sloučenin poskytuje nižší pH obvykle symetričtější píky
Ukázka reakce s aktivními místy	Přidejte činidlo pro iontové páry nebo těkavý základní modifikátor nebo vyměňte kolonu

Čelní čelo

Možná příčina	Řešení
Nízká teplota	Zvyšte teplotu kolony
Špatné rozpouštědlo vzorku	Pro injekční rozpouštědlo použijte mobilní fázi
Přetížení vzorku	Snižte koncentraci vzorku
Špatný sloupec	Vraťte proplach kolony (pokud je to povoleno) nebo vyměňte vstupní fritu (pokud je povoleno) nebo vyměňte kolonu.

Rozdělené vrcholy

Možná příčina	Řešení
Kontaminace na vstupu ochranné nebo analytické kolony	Odstraňte ochranný sloupek a zkuste analýzu. v případě potřeby vyměňte ochranný sloup. Pokud je analytická kolona ucpaná, obraťte se a propláchněte (pokud je to povoleno). Pokud problém přetrvává, kolona může být znečištěna silně zadrženými nečistotami. Použijte vhodný postup obnovy (viz informace o péči o sloupec). Pokud problém přetrvává, je pravděpodobně ucpaný přívod. Vyměňte fritu nebo vyměňte kolonu.
Rozpouštědlo vzorku nekompatibilní s mobilní fází	Vyměňte rozpouštědlo. kdykoli je to možné, vstřikujte vzorky v mobilní fázi.

Zkreslení větších vrcholů

Špičkové zkreslení může být způsobeno přetížením vzorku. Zmenšete velikost vzorku.

Zkreslení časných vrcholů

Zkreslení časně eluujících píku může být způsobeno nesprávným injekčním rozpouštědlem. Snižte injekční objem nebo použijte slabší injekční rozpouštědlo.

Ocas, rané vrcholy více než pozdější

Možná příčina	Řešení
Extra-sloupcové efekty	Proveďte výměnu systému (kratší, užší hadičky), použijte detekční celu s menším objemem

Zvýšený tailing s rostoucím k'

Možná příčina	Řešení
Sekundární retenční efekty, režim obrácené fáze	Přidejte triethylamin (základní vzorky) nebo přidejte acetát (kyselé vzorky) nebo přidejte sůl nebo pufr (iontové vzorky) nebo vyzkoušejte jinou kolonu.
Sekundární retenční efekty, režim normální fáze	Přidejte triethylamin (zásadité sloučeniny) nebo přidejte kyselinu octovou (kyselé sloučeniny) nebo přidejte vodu (polyfunkční sloučeniny). Pouze pro metody s normální fází, které používají rozpouštědla mísitelná s vodou. Můžete také zkusit jinou metodu LC.
Sekundární retenční efekty, iontová párová chromatografie	Přidejte triethylamin (základní vzorky)

Kyselý nebo bazický vrchol ocasu

Možná příčina	Řešení
Nedostatečné ukládání do vyrovnávací paměti	Použijte pufr o koncentraci 50 až 100 mM, použijte pufr s pKa rovným pH mobilní fáze

Extra vrcholy

Možná příčina	Řešení
Vrcholy duchů	Nečistoty ve vzorku, použitých činidlech nebo materiálu. Změňte postup čištění a/nebo zkontrolujte možný zdroj kontaminace (sklo, lahvičky, použitá činidla, rozpouštědla atd...)
Pozdní eluující pík z předchozí injekce	Zvyšte dobu chodu nebo sklon sklonu a/nebo zvyšte průtok

Posun retenční doby

Možná příčina	Řešení
Špatná regulace teploty	Použijte sloupový termostat. Pokud jej používáte, zkontrolujte jeho správnou funkčnost.
Změna mobilní fáze	Zabránit změnám (vypařování, reakce atd...)
Špatná ekvilibrace kolony	Mezi běhy ponechte více času na ekvilibraci kolony

Náhlé změny retenční doby

Možná příčina	Řešení
Změna průtoku	Resetujte průtok
Vzduchová bublina v čerpadle	Vypusťte vzduch z čerpadla
Nesprávná mobilní fáze	Vyměňte mobilní fázi za správnou a/nebo nastavte správnou směs mobilní fáze na ovladači

Posun základní linie

Možná příčina	Řešení
Kolísání teploty kolony. I malé změny způsobují cyklický vzestup a pokles základní linie. Nejčastěji ovlivňuje index lomu, UV a vodivostní detektory s vysokou citlivostí	Kontrolujte teplotu kolony a mobilní fáze, před detektorem použijte výměník tepla
Nehomogenní mobilní fáze. Posun základní linie je obvykle způsoben vyšší absorbancí, spíše než cyklickým vzorem z kolísání teploty.	Používejte rozpouštědla, vysoce čisté soli a přísady. Mobilní fázi před použitím odplyněte, během použití prostříkejte héliem.
Nahromadění nečistot nebo vzduchu v detekční cele	Propláchněte celu methanolem nebo jiným silným rozpouštědlem. V případě potřeby vyčistěte celu 1N HNO 3 (nikdy nepoužívejte HCl).
Zacpaná zásuvka za detektorem. Vysoký tlak poškozuje buňku a vytváří hlučnou základní linii.	Odpojte nebo vyměňte vedení. Informace o výměně okna naleznete v příručce k detektoru.
Problém míchání mobilní fáze nebo změna průtoku	Správné složení nebo průtok. Chcete-li se tomuto problému vyhnout, pravidelně sledujte složení a průtok.
Pomalá ekvilibrace kolony, zejména při změně mobilní fáze	Před analýzou propláchněte středně silným rozpouštědlem, proveďte 10 až 20 objemů kolony nové mobilní fáze
Mobilní fáze kontaminovaná, poškozená nebo připravená z materiálů nízké kvality	Příprava mobilní fáze Chack. Používejte chemikálie nejvyšší kvality a rozpouštědla pro HPLC
Silně zadržené materiály ve vzorku (vysoké k') mohou eluovat jako velmi široké píky a zdají se být rostoucí základní linií (analýzy gradientu mohou zhoršit problém).	Použijte ochranný sloup. Pokud je to nutné, proplachujte kolonu silným rozpouštědlem mezi nástřiky nebo pravidelně během analýzy.
Mobilní fáze je recyklována, ale detektor není seřízen	Resetovat základní linii. Při překročení dynamického rozsahu detektoru použijte novou mobilní fázi.
Detektor (UV) není nastaven na maximum absorbance, ale na sklon křivky	Změňte vlnovou délku na maximum UV absorbance

Základní hluk (pravidelný)

Možná příčina	Řešení
Vzduch v mobilní fázi, detekční buňka nebo čerpadlo	Odplynění mobilní fáze. Proplachovací systém pro odstranění vzduchu z detekční cely nebo čerpadla.
Unikat	Viz část Netěsnosti . Zkontrolujte systém, zda nejsou uvolněné armatury. Zkontrolujte čerpadlo, zda netěsní, nehromadí se sůl, nebo zda nevykazuje neobvyklý hluk. V případě potřeby vyměňte těsnění čerpadla.
Neúplné promíchání mobilní fáze	Promíchejte mobilní fázi ručně nebo použijte méně viditelný vzorek.
Teplotní efekt (kolona při vysoké teplotě nebo nevyhřívaný detektor)	Snižte diferenciál nebo přidejte výměník tepla
Další elektronická zařízení na stejné lince	izolujte LC, detektor nebo rekordér/PC, abyste zjistili, zda je zdroj problému externí. Opravte podle potřeby.
Pulzace čerpadla	Začlenit do systému tlumič pulsů.

Základní hluk (nepravidelný)

Možná příčina	Řešení
Unikat	Viz část Netěsnosti . Zkontrolujte systém, zda nejsou uvolněné armatury. Zkontrolujte čerpadlo, zda netěsní, nehromadí se sůl, nebo zda nevykazuje neobvyklý hluk. V případě potřeby vyměňte těsnění čerpadla.
Mobilní fáze kontaminovaná, poškozená nebo připravená z materiálů nízké kvality	Zkontrolujte přípravu mobilní fáze
Rozpouštědla mobilní fáze nemísitelná	Vybírejte a používejte pouze mísitelná rozpouštědla
Vzduch zachycený v systému	Propláchněte systém silným rozpouštědlem
Vzduchové bubliny v detektoru	Detektor čištění. Za detektorem nainstalujte protitlakové zařízení
Elektronika detektoru/rekordéru	Elektronicky izolujte detektor a záznamník/PC. Pro odstranění problému viz návod k obsluze.
Detekční buňka kontaminována (i malé množství kontaminantů může způsobit hluk)	Vyčistěte celu propláchnutím 1N HNO 3 (nikdy nepoužívejte HCl)
Slabá lampa detektoru	Vyměňte lampu
Kolona prosakující oxid křemičitý nebo obalový materiál	Vyměňte sloupek
Směšovač mobilní fáze je neadekvátní nebo nefunkční	Opravte nebo vyměňte mixér nebo mix off-line, pokud je izokratický.

Široké vrcholy

Možná příčina	Řešení
Složení mobilní fáze se změnilo	Připravte novou mobilní fázi
Průtok mobilní fáze je příliš nízký	Upravte průtok
Netěsnosti (zejména mezi kolonou a detektorem)	Viz část Netěsnosti . Zkontrolujte systém, zda nejsou uvolněné armatury. Zkontrolujte čerpadlo, zda netěsní, nehromadí se sůl, nebo zda nevykazuje neobvyklý hluk. V případě potřeby vyměňte těsnění čerpadla.
Nastavení detektoru není správné	Upravte nastavení
Koncentrace pufru je příliš nízká	Zvyšte koncentraci pufru
Ochranný sloupek je znečištěný/opotřebovaný	Vyměňte ochranný sloupek
Sloupec znečištěný/opotřebovaný. Nízké SPZ.	Vyměňte sloupec za nový stejného typu.
Prázdné na vstupu do kolony	Otevřete vstupní konec a vyplňte mezeru nebo vyměňte kolonu
Pík představuje dvě nebo více špatně rozlišených sloučenin	Změňte typ kolony pro zlepšení separace
Teplota kolony je příliš nízká	Zvyšte teplotu. Nepřekračujte 60 °C, pokud nejsou pro výrobce kolony přijatelné vyšší teploty.
Časová konstanta detektoru je příliš velká	Použijte menší časovou konstantu

Široké vrcholy mohou být způsobeny efekty mimo sloupec:

• Kolona je přetížena - vstříkněte menší objem (např. 10 µl místo 100 µl) nebo nařeďte vzorek
• Doba odezvy detektoru nebo příliš velký objem buňky – zkraťte dobu odezvy nebo použijte menší buňku
• Hadička mezi kolonou a detektorem je příliš dlouhá, vnitřní průměr je příliš velký – použijte co nejkratší kus hadičky o vnitřním průměru 0,007" až 0,010" (UHPLC techniky vyžadují použití hadičky s vnitřním průměrem 0,005")
• Příliš vysoká doba odezvy záznamníku – Zkraťte dobu odezvy

Ztráta rozlišení

Možná příčina	Řešení
Mobilní fáze kontaminovaná (zhoršená (způsobuje změnu retenční doby)	Připravte novou mobilní fázi
Ucpaná ochranná nebo analytická kolona	Odstraňte ochrannou kolonu a pokuste se provést analýzu. V případě potřeby vyměňte kryt. Pokud je analytická kolona ucpaná, obraťte se a propláchněte. Pokud problém přetrvává, kolona může být znečištěna silně zadrženými nečistotami. Použijte vhodný postup obnovy podle návodu výrobce. Pokud problém přetrvává, je pravděpodobně ucpaný přívod. Vyměňte fritu nebo vyměňte kolonu.

Všechny vrcholy jsou příliš malé

Možná příčina	Řešení
Příliš vysoký útlum detektoru	Snižte útlum
Časová konstanta detektoru je příliš velká	Použijte menší časovou konstantu
Velikost vstřiku je příliš malá	Zvyšte koncentraci vzorku nebo zvyšte injekční objem, pokud to velikost kolony umožňuje
Nesprávné připojení rekordéru	Použijte správné připojení

Všechny vrcholy jsou příliš velké

Možná příčina	Řešení
Útlum detektoru je příliš nízký	Použijte větší útlum
Velikost vstřiku je příliš velká	Snižte koncentraci vzorku nebo snižte vstřikovaný objem, použijte menší vzorkovací smyčku nebo použijte částečné plnění smyčky
Nesprávné připojení rekordéru	Použijte správné připojení

---

Problémy s injektorem

Manuální vstřikovač, těžko se otáčí

Možná příčina	Řešení
Poškozené těsnění rotoru	Přestavte nebo vyměňte těsnění/ventil
Rotor je příliš utažený	Upravte napětí rotoru

Manuální vstřikovač, těžké naplnění

Možná příčina	Řešení
Špatně seřízený ventil	Upravte zarovnání
Blokovaná smyčka	Vyměňte smyčku
Špinavá injekční stříkačka	Vyčistěte nebo vyměňte injekční stříkačku
Blokované linky	Vymažte nebo vyměňte řádky

Vstřikovač autosampleru - neotáčí se

Možná příčina	Řešení
Žádný tlak vzduchu ani síla	Zajistěte správný tlak/výkon
Rotor je příliš utažený	Upravit
Špatně seřízený ventil	Upravte zarovnání

Autosampler - další problémy

Možná příčina	Řešení
Ucpání	Vyčistěte nebo vyměňte zablokovanou část
Zaseknutý mechanismus	Viz servisní příručka
Vadný ovladač	Opravte nebo vyměňte ovladač

---

Problémy zjištěné čichem, zrakem nebo zvukem

Vůně rozpouštědla

Možná příčina	Řešení
Unikat	Viz část Netěsnosti
Rozlít	Zkontrolujte, zda nádoba na odpad nepřetéká, nebo vyhledejte únik a ukliďte

"Horký" zápach

Možná příčina	Řešení
Modul přehřívání	Zkontrolujte správnou ventilaci, upravte ji nebo zkontrolujte nastavení teploty, seřiďte nebo vypněte modul, viz servisní příručka

Abnormální stavy měřidel

Možná příčina	Řešení
Abnormalita tlaku	Viz část Abnormální tlak
Problém se sloupovou troubou	Zkontrolujte nastavení a upravte, viz servisní příručka
Detekční lampa selhává	Vyměňte lampu

Výstražné lampy

Možná příčina	řešení
Překročen tlakový limit	Zkontrolujte ucpání nebo zkontrolujte nastavení limitů a upravte je
Další výstražné kontrolky	Viz návod k obsluze/servisu

Výstražné bzučáky

Možná příčina	Řešení
Únik/rozlití rozpouštědla	Najděte a opravte
Další varovné bzučáky	Viz návod k obsluze/servisu

Skřípání a pískání

Možná příčina	Řešení
Selhání ložiska	Viz servisní příručka
Špatné mazání	Podle potřeby namažte
Mechanické opotřebení	Viz servisní příručka

---

Klíčové problémové oblasti a preventivní údržba

Nádrž

Problém	Řešení/preventivní údržba
Zablokovaná vstupní frita	Vyměňte každé 3 až 6 měsíců a filtrujte mobilní fázi přes 0,5µm filtr
Plynové bubliny	Odplynění mobilní fáze

Čerpadlo

Problém	Řešení/preventivní údržba
Vzduchové bubliny	Odplyněte mobilní fázi, zkontrolujte těsnost
Selhání těsnění čerpadla	Každé 3 měsíce vyměňte těsnění čerpadla
Selhání kontrolního ventilu	Filtrujte mobilní fázi, použijte fritu ze vstupního potrubí. Nechte si jeden náhradní.

Injektor

Problém	Řešení/preventivní údržba
Opotřebení těsnění rotoru	Vzorky příliš neutahujte a nefiltrujte

Sloupec

Problém	Řešení/preventivní údržba
Zablokovaná frita	Filtrujte mobilní fázi, filtrujte vzorky, použijte in-line filtr a/nebo ochrannou kolonu
Prázdný v čele sloupce	Vyhněte se mobilní fázi pH>8 (většina kolon na bázi oxidu křemičitého), použijte ochrannou kolonu, použijte předkolonu (saturační kolonu)

Detektor

Problém	Řešení/preventivní údržba
Selhání lampy	Vyměňte lampu
Snížená odezva detektoru	Žárovku pravidelně vyměňujte podle návodu k obsluze (uchovejte si náhradní žárovku)
Zvýšený šum detektoru	Žárovku pravidelně vyměňujte podle návodu k obsluze (uchovejte si náhradní žárovku)
Bubliny v buňce	Udržujte celu v čistotě nebo použijte omezovač po cele nebo odplynění mobilní fáze.

Všeobecné

Problém	Řešení/preventivní údržba
Korozivní/abrazivní poškození	Vypláchněte pufr z LC a vyčistěte, když se nepoužívá