MetAmino - souprava pro přípravu vzorků

Úvod

Aminokyseliny jsou klíčovými stavebními kameny života a hrají klíčovou roli v různých metabolických drahách. Vzhledem k jejich chemické složitosti a dynamickému rozsahu je jejich spolehlivá kvantitativní a kvalitativní analýza v biologických tekutinách a tkáních zásadní pro nutriční informace, identifikaci sloučenin a diagnostiku.

Za tímto účelem byla vyvinuta jednoduchá, elegantní a dosud nejrychlejší metoda pro analýzu aminokyselin. Kit MetAmino^® na bázi LC/GC-MS nabízí komplexní řešení pro 75 metabolitů včetně základních proteinogenních aminokyselin, biogenních aminů a koenzymů s možností dalšího rozšíření analytů.

Vlastnosti

• V zásadě vhodný pro jakékoli matrice (moč, krevní sérum, slzy, mozková tekutina, tkáňové extrakty, půdní extrakty atd.)
• Snadná příprava vzorku
• Derivatizace a analýza vzorků do 20 minut
• Široké portfolio analytů (75) s možností dalšího rozšíření
• Není potřeba žádné zahřívání/zmrazování vzorku
• K dispozici knihovna NIST pro GC/MS
• Lze určit látky s nízkou molekulovou hmotností, které mohou být degradovány v iontovém zdroji (např. GLY, ALA atd.)
• Vhodné pro analýzu obtížně kvantifikovatelných látek, jako jsou polyaminy
• Součástí jsou všechna potřebná činidla, příslušenství, HPLC kolona a návod pro derivatizaci a analýzu s vysokou přesností a citlivostí

Chromatogramy

Obr. 1: Chromatogram vnitřních standardů, SD1 a SD2. Separace 5 nmol aminokyselin pomocí LC-MS MetAmino^®

Obr. 2: Chromatogram reálného vzorku: Separace aminokyselin ve vzorku piva Budvar 12˚ (25 µl vzorku bylo nastříknuto na kolonu). Vysoká účinnost naší kolony a vysoké rozlišení přispívají k pěkné separaci píků. Vzorek testován pomocí LC-MS MetAmino^®

Obr. 3: Chromatogram reálného vzorku: Separace aminokyselin přítomných v krevním séru (25 µL vysráženého séra bylo nastříknuto na kolonu). Vysoká účinnost naší kolony a vysoké rozlišení přispívají k pěkné separaci píků. Vzorek testován pomocí LC-MS MetAmino^®

Příprava vzorků

Níže je uvedený stručný postup přípravy vzorku. Podrobný postup naleznete v uživatelské příručce MetAmino^®.

Příprava vzorku pro LC-MS analýzu probíhá následovně:

1. Napipetujte 100 μl vašeho vzorku (sérum, plazma, ...) do centrifugační zkumavky a přidejte 100 μL precipitačního média. Centrifugujte 30 až 60 sekund při 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
2. Napipetujte 25 μl vašeho vysráženého vzorku do nové centrifugační zkumavky a přidejte 10 μl roztoku s vnitřními standardy.
3. Napipetujte 20 μl katalytického roztoku a 5-10 sekund vortexujte.
4. Napipetujte 10 μl reagenčního (derivatizačního) činidla a vortexujte 5-10 sekund. Nechte derivatizaci probíhat alespoň 2-3 minuty.
5. Aktivujte a ekvilibrujte sorbent v MSPE filtru přidáním:
   1. 200 μl aktivačního média sorbentu MSPE, poté centrifugujte 30 až 60 sekund při 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
   2. 200 μl ekvilibračního média sorbentu MSPE, poté centrifugujte 30 až 60 sekund při 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
6. Vylijte eluát prošlý membránou.
7. Derivatizační reakční směs nařeďte 400 μl ředícího a promývacího média a vortexujte 5-10 sekund.
8. Zředěnou reakční směs (typicky 450-500 μl) napipetujte na aktivovaný a naekvilibrovaný MSPE filtr a nechte 1-2 minuty stát. Centrifugujte 30 až 60 sekund při 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
9. Vylijte eluát prošlý membránou.
10. Promyjte sorbent v MSPE filtru 200 μl ředícího a promývacího média a centrifugujte 30 až 60 sekund při 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
11. Umístěte MSPE filtr do nové centrifugační zkumavky, přidejte 200 μl elučního média a centrifugujte 30 až 60 sekund při 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
12. Přeneste eluát do nové vialky a umýstěte jej do autosampleru. Vzorek je připraven pro LC-MS analýzu.

Příprava vzorku pro GC-MS analýzu probíhá následovně:

1. Do reakční skleněné zkumavky napipetujte 25 μl vzorku a 10 μl roztoku s vnitřními standardy.
2. Do reakční skleněné zkumavky napipetujte 20 μl redukčního činidla a krátce, 5 až 10 sekund, vortexujte. Nechte 1 až 2 minuty odstát.
3. Do reakční skleněné zkumavky napipetujte 25 μl základního roztoku.
4. Potom přidejte 50 μl reagenčního (derivatizačního) činidla a vortexujte 5 až 10 sekund.
5. Napipetujte 25 μl katalytického roztoku do reakční skleněné zkumavky a 5 až 10 sekund vortexujte.
6. Znovu napipetujte 25 μl katalytického roztoku do reakční skleněné zkumavky a 5 až 10 sekund vortexujte. Nechte 1-2 minuty odstát. Emulze se postupně rozdělí na dvě vrstvy.
7. Napipetujte 50 μl extrakčního média do reakční skleněné zkumavky a 5 až 10 sekund vortexujte.
8. Napipetujte 25 μl kyselého média do reakční skleněné zkumavky a 5 až 10 sekund vortexujte. Poté centrifugujte 30 až 60 sekund 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
9. Přeneste organickou (horní) vrstvu (50-100 µL) do autosamplerové vialky s insertem. Vzorek je připraven pro analýzu GC-MS.

Obsah sady

MetAmino^® kit obsahuje všechna činidla, média a chemikálie. Obsah startovací sady je uveden v tabulkách níže:

Obsah soupravy LC-MS pro 100 vzorků:

Obsah soupravy GC-MS pro 100 vzorků:

Popis

Naše sady MetAmino^® LC-MS a GC-MS poskytují rychlou, robustní, reprodukovatelnou a precizní metodu pro analýzu aminokyselin, která zahrnuje jak přípravu vzorků, tak i chromatografickou separaci.

Metoda využívající LC-MS je založena na mikro-extrakci na pevné fázi využívající speciální mikrospin filtry (MSPE) s nově vyvinutým sorbentem a integrovanou membránou 0,22 µm, metoda GC-MS využívá pro přípravu mikroextrakci kapalina-kapalina (LLME). Po této předúpravě je vzorek analyzován v LC-MS (GC-MS). Celkově trvá příprava vzorku pro LC-MS asi 8 minut a analýza vzorku 12 minut, takže celá doba experimentu je pouhých 20 minut. Celková doba experimentu GC-MS je dokonce kratší – zhruba 17 minut.

Tato jedinečná sada splňuje všechny požadavky laboratoří a je navržena pro všechny koncové uživatele, kteří hledají jednoduchou analytickou metodu a vysokou účinnost separace.

MetAmino FAQ

Jaký je typ membrány uvnitř spin filtru?

• Membrána je vyrobena z materiálu NYLON a její porozita je 0,22 µm. Její průměr je optimalizovaný pro použití s daným spin filtrem.

Je možné rozšířit MetAmino^® kit o další analyty?

• Ano, MetAmino^® kit je možné dále rozšiřovat. Kontaktujte nás s detailními informacemi.

Můžu použít MetAmino^® kit pro analýzu moči?

• Ano, MetAmino^® kit lze použít pro analýzu moči. Vzorek nesmí obsahovat bílkoviny, takže před použitím kitu musí být upraven běžným způsobem (odstřeďování, filtrace).

Můžeme objednat reagencie samostatně?

• Ano, celou soupravu reagencií je možné objednat pod katalogovým číslem MAK-5857-L002.

Jaký je tlak v průběhu LC/MS analýzy?

• Na začátku analýzy je tlak 380 barů, na konci je 200 barů.

Jsou MRM pro aminokyseliny uvedené v MetAmino^® kitu vytvořeny po derivatizaci standardů nebo před ní?

• Přechody MRM pro AA uvedené v návodu jsou uvedeny jako přechody derivátů AA a nikoli nativních AA.

Měl by být vzorek krmiva před prací se soupravou MetAmino^® kitu hydrolyzován?

• Precipitace pomocí precipitačního média (PM) není nezbytným krokem pro úspěšnou derivatizaci vzorku. Kit byl testován především pro analýzu biofluidů, které často obsahují peptidy. Aby se zabránilo jejich srážení během derivatizace, byl krok srážení zahrnut do protokolu přípravy vzorku.
• Pokud je vyžadována celková analýza volných a na peptid vázaných aminokyselin, v tomto případě bychom doporučili vzorek hydrolyzovat a poté alikvot hydrolyzovaného vzorku vysušit pod proudem dusíku nebo ve speedvacu. Vysušený zbytek rozpusťte ve 25 µl deionizované vody nebo 0,1M vodné HCl (pro lepší rozpustnost) a postupujte podle návodu přidáním 10 µl roztoku IS.
• Pokud jde o hydrolýzu peptidů, používaná aditiva (fenol, thiodiglykol) v hydrolyzačním médiu by také mohla být derivatizována (pravděpodobně nebudou vidět ve "full scan"). Proto jako hydrolyzační médium doporučujeme 6M HCl.

Můžeme si objednat MetAmino^® GC/MS kit pro přípravu 400 vzorků?

• Zatím ne, v současné době máme pouze MetAmino^® GC/MS kit pro přípravu 100 vzorků. Tuto soupravu lze objednat pod katalogovým číslem MAK-5857-BA01.

V tabulce je 78 aminokyselin, z nichž některé nejsou v dostupných mixech standardů – máme se tedy spoléhat na MRM přechody a dívat se na retenční čas nebo jsou to standardy, které bychom si měli koupit, pokud je chceme určovat?

• Pro účely kvantifikace obsahuje sada MetAmino - jedna lahvička standardního roztoku SD1 obsaženého v sadě obsahuje 33 aminokyselin: AAA, ABA, ALA, APA, ARG, ASP, BAIBA, CC, CIT, CTH, GABA, GLU, GLY, GPR , HIS, HLY, HYP, ILE, LEU, LYS, MET, 1MHIS, 3MHIS, ORN, PHE, PHP, PRO, SAR, SER, THR, TPR, TYR, VAL a lahvička SD2 s lyofilizovanou směsí 3 aminokyselin: ASN, GLN, TRP. Sada aminokyselin však může být dále rozšířena na další sloučeniny obsahující primární nebo sekundární amino funkční skupiny.
• Hmotnosti (m/z) uvedené v příručce jsou správné a představují ionty M+H+. Hmotnosti (m/z) a retenční časy z manuálu byly získány z přístroje LTQ s lineární iontovou pastí, avšak data z Certifikátu analýzy byla získána z přístroje Q Exactive plus HRMS. V obou případech byla použita stejná kolona, průtok a složení mobilní fáze. Retenční časy (RT) jsou experimentální hodnoty a nesrovnalosti, zejména u sloučenin s pozdní elucí, by byly způsobeny použitím různých LC/MS přístrojů.