Chromatografie

Přípustné úpravy metod HPLC

V této technické poznámce jsou uvedeny HPLC kolony Chromservis odpovídající USP metodám a rozsah, v jakém lze různé parametry chromatografického testu upravit bez zásadních změn lékopisných analytických postupů. Jiné než uvedené změny vyžadují revalidaci postupu.

TN524_Allowable Adjustments to HPLC Methods 983 kB

Dávkování vzorku ve Flash chromatografii

Kapalné nebo pevné vzorky s malým nebo velkým objemem - protože jsou vaše vzorky rozmanité, nabízíme několik možností dávkování na kolonu, abychom zaručili co možná nejlepší výsledky.

"Dry load"

K dispozici jsou jednorázové plastové vyrianty "Dry load" kolonek nebo kolonky ve verzi z nerezové oceli. Ty jsou opakovaně použitelné a mají také výhodu větší odolnosti vůči vyššímu tlaku.
S nerezovou kolonkou "Dry load" můžete provádět nástřiky pevných látek na preparativní kolonu nebo na flash kolonky, kde by maximální tlaková odolnost plastové kolnonky byla nedostatečná.

Dávkovací smyčky

Naše řada dávkovacích smyček nabízí objemy od 100 μL do 50 mL, takže vyhovíme všem vašim potřebám.

Autosampler

Automatizujte dávkování vzorku pomocí našeho autosampleru a zvyšte svůj výkon desetinásobně. PuriFlash^® AS-1 umožňuje dávkování vzorků od 50 µL do 500 mL s automatickým čištěním používaných zkumavek mezi každým nástřikem.

Dávkování vzorku zajišťuje sekvence softwaru InterSoft . Autosampler může být vybavený 6-cestným nebo 10-cestným elektrickým ventilem.

Platforma autosampleru má možnosti použití stojánku pro zkumavky nebo láhve až do objemu 250 mL, případně použití stojanů na míru.

Dávkovací čerpadlo

Máte-li veliké objemy vzorku, které potřebujete dávkovat na Flash nebo preparativní kolonu, stačí použít naše čerpadlo a poté spustit metodu. Je to tak snadné!

Stacionární fáze pro HPLC

ASTRA - CHROMSERVIS

Typ fáze	Velikost částic (µm)	Velikost pórů (Å)	Plocha povrchu (m²/g)	% uhlíku	Rozsah pH
C18-HE	2, 3, 5, 10	100	330	17	2-9
C18-AQ	2. 3, 5	100	330	13	2-9
C18-BDS	3, 5	140	170	11	2-8
C8-HE	5	100	330	11	2-9
C8-BDS	3, 5	140	170	6	2-8
Phenyl-Hexyl-HE	3, 5	100	330	11	2-7.5
DM	3, 5	100	205	12	2-9
Diol	3, 5	100	330	5	2-7.5

ARION - CHROMSERVIS

Typ fáze	Velikost částic (µm)	Velikost pórů (Å)	Plocha povrchu (m²/g)	% uhlíku	Rozsah pH
Plus C18	1.7, 2.2, 3, 5, 10, 15	100	420	18	1.5-10
Polar C18	2.2, 3, 5, 10, 15	120	325	16	1.5-7.0
C8	3, 5	120	325	11	2.0-7.0
Phenyl-butyl	2.2, 3, 5	100	300	12	1.5-7.5
NH2	2.2, 3, 5	120	325	5	2.0-6.5
CN	3, 5, 10	120	325	8	2.0-7.0
HILIC Plus	2.2, 3, 5	120	420	-	1.5-7.0
Si	2.2, 3, 5, 10	100	420	-	1.5-7.0
SAX	5	120	325	-	1.0-7.5
SCX	5	120	325	-	1.0-7.5

Na našich stránkách naleznete i návod, jak se starat o (U)HPLC kolony Arion.

CHROMSHELL - CHROMSERVIS

Typ fáze	Velikost částic (µm)	Velikost pórů (Å)	Efektivní plocha povrchu (m²/g)	% uhlíku	Rozsah pH
CHROMSHELL^® C18 Plus	2.6	85	130	9	1.5-7.5
CHROMSHELL^® C18-XB	2.6	85	130	8	1.5-8.0
CHROMSHELL^® C18 Polar	2.6	85	130	6.5	1.5-7.0

KINETEX - PHENOMENEX

Typ fáze	Velikost částic (µm)	Velikost pórů (Å)	Efektivní plocha povrchu (m²/g)	% uhlíku	Rozsah pH
Kinetex XB-C18	5, 2.6	100	200	10	1.5-8.5*
Kinetex C18	5, 2.6	100	200	12	1.5-8.5*
Kinetex C8	2.6	100	200	8	1.5-8.5*
Kinetex PFP	5, 2.6	100	200	9	1.5-8.5*
Kinetex HILIC	2.6	100	200	0	2.0-7.5
Kinetex Phenyl-Hexyl	5, 2.6	100	200	11	1.5-8.5*

*Kolony mají stabilitu v rozsahu pH 1.5 až 10 za isokratických podmínek. Při gradientních elucích je jejich stabilita v rozsahu pH 1.5 až 8.5.

Kolony Kinetex 2.6µm s ID 2.1mm jsou stabilní do tlaku 1000 bar, jinak do 600 bar.

Vyzkoušejte kolony ChromShell, kterými kolony Kinetex můžete nahradit.

LUNA - PHENOMENEX

Typ fáze	Velikost částic (µm)	Velikost pórů(Å)	Plocha povrchu (m²/g)	% uhlíku	Rozsah pH	USP kód
Luna Phenyl-Hexyl	3,5,10,15	100	400	17.5	1.5-10.0	L11
Luna Silica (2)	3,5,10,15	100	400	-	-	L3
Luna C5	5,10	100	440	12.5	1.5-10.0	-
Luna C8	5,10	100	440	14.75	1.5-10.0	L7
Luna C8 (2)	3,5,10,15	100	400	13.5	1.5-10.0	L7
Luna C18	5,10	100	440	19	1.5-10.0	L1
Luna C18 (2)	2.5,3,5,10,15	100	400	17.5	1.5-10.0	L1
Luna CN	3,5,10	100	400	7.0	1.5-10.0	L10
Luna NH₂	3,5,10	100	400	9.5	1.5-11.0	L8
Luna SCX	5,10	100	400	0.55% Sulfur Load	2.0-7.0	L9
Luna HILIC	3,5	200	200	-	1.5-8.0	-
Luna PFP(2)	3 5	100	400	5.7	1.5-8.0	L43

GEMINI - PHENOMENEX

Typ fáze	Velikost částic (µm)	Velikost pórů (Å)	Plocha povrchu (m²/g)	% uhlíku	Rozsah pH	USP kód
Gemini C18	3,5,10	110	375	14	1.0-12.0	L1
Gemini C6-Phenyl	3,5	110	375	12	1.0-12.0	L11
Gemini NX	3,5,10	110	375	14	1.0-12.0	L1

SYNERGI - PHENOMENEX

Typ fáze	Velikost částic (µm)	Velikost pórů(Å)	Plocha povrchu (m²/g)	% uhlíku	Rozsah pH	USP kód
Synergi Max-RP	2.5	100	400	17	1.5-10.0	-
Synergi Hydro-RP	2.5	100	400	19	1.5-7.5	L1
Synergi Polar-RP	2.5	100	440	11	1.5-7.0	L11
Synergi Fusion-RP	2.5	100	440	12	1.5-10.0	L1
Synergi Max-RP	4,10	80	475	17	1.5-10.0	-
Synergi Hydro-RP	4,10	80	475	19	1.5-7.5	L1
Synergi Polar-RP	4,10	80	475	11	1.5-7.0	L11
Synergi Fusion-RP	4,10	80	475	12	1.5-10.0	L1

ONYX - PHENOMENEX

Typ fáze	Velikost makropórů (µm)	Velikost pórů (Å)	Plocha povrchu (m²/g)	% uhlíku	Rozsah pH	USP kód
Onyx Silica	2	130	300	0	2.0-7.5	-
Onyx C8	2	130	300	11	2.0-7.5	-
Onyx C18	2	130	300	18	2.0-7.5	-

JUPITER - PHENOMENEX

Typ fáze	Velikost částic (µm)	Velikost pórů (Å)	Plocha povrchu (m²/g)	% uhlíku	Rozsah pH	USP kód
Jupiter C4	5,10,15	300	170	5.0	1.5-10.0	L26
Jupiter C5	5,10,15	300	170	5.5	1.5-10.0	-
Jupiter C18	5,10,15	300	170	13.3	1.5-10.0	L1
Jupiter Proteo C12	4,10	90	475	15.0	1.5-10.0	-

GraceSmart - GRACE

Typ fáze	Velikost částic(µm)	Velikost pórů (Å)	Plocha povrchu (m²/g)	% uhlíku	Rozsah pH	USP kód
GraceSmart C18	3,5	120	220	10	2.0-9.0	L1

Alltech^® Prevail - GRACE

Typ fáze	Velikost částic(µm)	Velikost pórů (Å)	Plocha povrchu (m²/g)	% uhlíku	USP kód
Prevail C18	3,5	110	350	17	L1
Prevail C18 Select	3,5	110	350	15	L1
Prevail C8	3,5	110	350	8	L7
Prevail Phenyl	3,5	110	350	7	L11
Prevail Cyano (CN)	3,5	110	350	-	L10
Prevail Amino (NH₂)	3,5	110	350	-	L8
Prevail Silica	3,5	110	350	-	L3
Prevail Organic Acid	3,5	110	350	-	-
Carbohydrate ES (polymer)	5	-	-	-	-

Kapilární / Nano LC kolony ProteCol - SGE

Typ fáze	Velikost částic(µm)	Velikost pórů (Å)	Plocha povrchu (m²/g)	% uhlíku	Rozsah pH	USP kód
ProteCol C18	3	120/300	350	17	2.0-7.5	L1
ProteCol C8	3	120/300	350	10	2.0-7.5	L7
ProteCol C4	3	120/300	350		2.0-7.5	L26
ProteCol SCX	3	120/300	350		2.0-7.5	L9

JAK SPRÁVNĚ UZAVÍRAT KRIMPOVACÍ VIALKY

Krimpovací vialky jsou výbornou vzorkovnicí pro automatické dávkovače plynových a kapalinových chromatografů a pro skladování vzorků nebo kalibračních roztoků. Technika jejich uzavírání je velmi důležitá pro správnou těsnost. Díky netěsnosti způsobené nesprávným uzavřením, může dojít k odpaření rozpouštědla nebo ke ztrátě analytů.
Správně uzavřená vialka se pozná podle toho, že se její víčko po uzavření protáčí ztěžka a septum je rovné.
Vialka, která je uzavřená příliš velkou silou se pozná podle toho, že jejím víčkem nelze zpravidla vůbec otáčet a navíc má prohnuté septum (směrem dovnitř). Dojde-li k propíchnutí septa jehlou mikrostříkačky, dojde k velkému namáhání septa a tím k narušení těsnosti vialky.
Vialka, která nemá správně uzavřené víčko, díky malé síle krimpovacích kleští, se projevuje snadným otáčením víčka a v některých případech i neobepnutým hliníkovým materiálem kolem spodního okraje límce vialky.
Správnou sílu uzavíracích kleští můžete nastavit.
U starších typů kleští se nastavení síly provádí otáčením imbusového klíče uvnitř čelistí. Kleště mívají i dorazový šroub, kterým se nastavuje bezpečnostní vzdálenost, aby nedošlo k použití příliš vysoké síly a tím k netěsnosti nebo dokonce k mechanickému poškození vialky.

Chromatogramy

Obr. 1: Chromatogram vnitřních standardů, SD1 a SD2. Separace 5 nmol aminokyselin pomocí LC-MS MetAmino^®

Obr. 2: Chromatogram reálného vzorku: Separace aminokyselin ve vzorku piva Budvar 12˚ (25 µl vzorku bylo nastříknuto na kolonu). Vysoká účinnost naší kolony a vysoké rozlišení přispívají k pěkné separaci píků. Vzorek testován pomocí LC-MS MetAmino^®

Obr. 3: Chromatogram reálného vzorku: Separace aminokyselin přítomných v krevním séru (25 µL vysráženého séra bylo nastříknuto na kolonu). Vysoká účinnost naší kolony a vysoké rozlišení přispívají k pěkné separaci píků. Vzorek testován pomocí LC-MS MetAmino^®

Příprava vzorků

Níže je uvedený stručný postup přípravy vzorku. Podrobný postup naleznete v uživatelské příručce MetAmino^®.

Příprava vzorku pro LC-MS analýzu probíhá následovně:

Napipetujte 100 μl vašeho vzorku (sérum, plazma, ...) do centrifugační zkumavky a přidejte 100 μL precipitačního média. Centrifugujte 30 až 60 sekund při 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
Napipetujte 25 μl vašeho vysráženého vzorku do nové centrifugační zkumavky a přidejte 10 μl roztoku s vnitřními standardy.
Napipetujte 20 μl katalytického roztoku a 5-10 sekund vortexujte.
Napipetujte 10 μl reagenčního (derivatizačního) činidla a vortexujte 5-10 sekund. Nechte derivatizaci probíhat alespoň 2-3 minuty.
Aktivujte a ekvilibrujte sorbent v MSPE filtru přidáním:
1. 200 μl aktivačního média sorbentu MSPE, poté centrifugujte 30 až 60 sekund při 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
2. 200 μl ekvilibračního média sorbentu MSPE, poté centrifugujte 30 až 60 sekund při 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
Vylijte eluát prošlý membránou.
Derivatizační reakční směs nařeďte 400 μl ředícího a promývacího média a vortexujte 5-10 sekund.
Zředěnou reakční směs (typicky 450-500 μl) napipetujte na aktivovaný a naekvilibrovaný MSPE filtr a nechte 1-2 minuty stát. Centrifugujte 30 až 60 sekund při 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
Vylijte eluát prošlý membránou.
Promyjte sorbent v MSPE filtru 200 μl ředícího a promývacího média a centrifugujte 30 až 60 sekund při 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
Umístěte MSPE filtr do nové centrifugační zkumavky, přidejte 200 μl elučního média a centrifugujte 30 až 60 sekund při 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
Přeneste eluát do nové vialky a umýstěte jej do autosampleru. Vzorek je připraven pro LC-MS analýzu.

Příprava vzorku pro GC-MS analýzu probíhá následovně:

Do reakční skleněné zkumavky napipetujte 25 μl vzorku a 10 μl roztoku s vnitřními standardy.
Do reakční skleněné zkumavky napipetujte 20 μl redukčního činidla a krátce, 5 až 10 sekund, vortexujte. Nechte 1 až 2 minuty odstát.
Do reakční skleněné zkumavky napipetujte 25 μl základního roztoku.
Potom přidejte 50 μl reagenčního (derivatizačního) činidla a vortexujte 5 až 10 sekund.
Napipetujte 25 μl katalytického roztoku do reakční skleněné zkumavky a 5 až 10 sekund vortexujte.
Znovu napipetujte 25 μl katalytického roztoku do reakční skleněné zkumavky a 5 až 10 sekund vortexujte. Nechte 1-2 minuty odstát. Emulze se postupně rozdělí na dvě vrstvy.
Napipetujte 50 μl extrakčního média do reakční skleněné zkumavky a 5 až 10 sekund vortexujte.
Napipetujte 25 μl kyselého média do reakční skleněné zkumavky a 5 až 10 sekund vortexujte. Poté centrifugujte 30 až 60 sekund 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
Přeneste organickou (horní) vrstvu (50-100 µL) do autosamplerové vialky s insertem. Vzorek je připraven pro analýzu GC-MS.

Obsah sady

MetAmino^® kit obsahuje všechna činidla, média a chemikálie. Obsah startovací sady je uveden v tabulkách níže:

Obsah soupravy LC-MS pro 100 vzorků:

Položka	Typ vialky	Objem ve vialce (ml)	Počet vialek (100 vzorků)
Standardy aminokyselin SD1 roztok	2 ml vialka	0,25	1
Standardy aminokyselin SD2 v práškové formě	2 ml vialka	-	2
Roztok s vnitřními standardy (IS)	2 ml vialka	1,1	1
Aminokyselinové standardní ředící médium (AASDM)	4 ml vialka	1,4	1
Aktivační médium sorbentu MSPE (WES)	40 ml vialka	22	1
Ekvilibrační médium sorbentu MSPE (EQS)	40 ml vialka	22	1
Katalytický roztok (CTS)	4 ml vialka	2,2	1
Reagenční (derivatizační) činidlo (RDS)	4 ml vialka	1,1	1
Ředicí a promývací médium (DWM)	40 ml vialka	33	2
Eluční médium (ELM)	40 ml vialka	22	1
Precipitační médium (PM)	40 ml vialka	11	1

Položka	Množství (100 vzorků)	Poznámka
MetAmino^® HPLC kolona	1 ks	Speciální stacionární fáze
Stojánek až pro 80 centrifugačních zkumavek	1 ks
Microspin filtry se sorbentem MetAmino^®	100 ks	Vnitřní kolonka vč. 0,22µm membrány
Centrifugační zkumavky (2 ml)	400 ks
Autosamplerové vialky (9 mm šroubovací uzávěr)	100 ks	Včetně sept a víček

Obsah soupravy GC-MS pro 100 vzorků:

Položka	Typ vialky	Objem ve vialce (ml)	Počet vialek (100 vzorků)
Standardy aminokyselin SD1 (roztok)	2 ml vialka	0,25	1
Standardy aminokyselin SD2 v práškové formě	2 ml vialka	-	2
Roztok s vnitřními standardy (IS)	2 ml vialka	1,1	1
Aminokyselinové standardní ředící médium (AASDM)	4 ml vialka	1,4	1
Redukční činidlo (RA)	4 ml vialka	2,75	1
Základní roztok (BM)	4 ml vialka	2,75	1
Katalytický roztok (CTS)	40 ml vialka	5,5	1
Reagenční (derivatizační) činidlo (RDS)	40 ml vialka	5,5	1
Extrakční médium (EM)	40 ml vialka	5,5	1
Kyselé médium (AM)	4 ml vialka	2,75	1

Položka	Množství	Poznámka
MetAmino^® GC kolona	1 ks	Speciální stacionární fáze
Reakční skleněné zkumavky	100 ks	-
Stojánek až pro 80 reakčních zkumavek
Autosamplerové vialky (9 mm šroubovací uzávěr)	100 ks	Včetně sept a víček
Inserty do vialek autosampleru	100 ks	-

Popis

Naše sady MetAmino^® LC-MS a GC-MS poskytují rychlou, robustní, reprodukovatelnou a precizní metodu pro analýzu aminokyselin, která zahrnuje jak přípravu vzorků, tak i chromatografickou separaci.

Metoda využívající LC-MS je založena na mikro-extrakci na pevné fázi využívající speciální mikrospin filtry (MSPE) s nově vyvinutým sorbentem a integrovanou membránou 0,22 µm, metoda GC-MS využívá pro přípravu mikroextrakci kapalina-kapalina (LLME). Po této předúpravě je vzorek analyzován v LC-MS (GC-MS). Celkově trvá příprava vzorku pro LC-MS asi 8 minut a analýza vzorku 12 minut, takže celá doba experimentu je pouhých 20 minut. Celková doba experimentu GC-MS je dokonce kratší – zhruba 17 minut.

Tato jedinečná sada splňuje všechny požadavky laboratoří a je navržena pro všechny koncové uživatele, kteří hledají jednoduchou analytickou metodu a vysokou účinnost separace.

Přehled sorbentů MSPE

Sorbenty pro techniku MSPE jsou zvoleny tak, aby pokryly co nejširší pole aplikací. MSPE SpeExtra C18 je hydrofóbní typ oktadecyl silikagelu se speciálním endcappingem s velmi širokým uplatněním. Je vhodný pro celou řadu analytů, horší retenci vykazuje pro polární sloučeniny. MSPE SpeExtra C18-P je polárně modifikovaný monomerní oktadecyl silikagel . Nabízí různé typy interakcí: dipól-dipól, π- π a hydrofóbní. Je tedy vhodný pro aromatické a polární sloučeniny. MSPE SpeExtra HLB polymerní sorbent s vysokým měrným povrchem a speciálním endcappingem. Má hydrofilní a lipofilní modifikaci zajišťující univerzální použití a vyšší kapacitu než C18 silikagel. MSPE SpeExtra WAX je polymerní sorbent na bázi PS/DVB se speciálním end-cappingem a vysoce specifickým povrchem, který se připravuje kopolymerací styrenu a divinylbenzenu, přičemž vytváří slabé aniontové interakce.

MSPE sorbent	Velikost částic [µm]	Měrný povrch [m²/g]
C18	60	310
C18-P	60	310
HLB	30	850
WAX	30	850

Čištění a testování konopí

Konopí obsahuje stovky kanabinoidů, přičemž kanabidiol (CBD) je v rostlině nejrozšířenější a Δ 9-Tetrahydrocannabinol (THC) je aktivní složkou způsobující psychotropní účinky. Existuje však mnohem více sloučenin, které jsou vytvářeny rostlinou konopí a byly zkoumány pro jejich lékařské účinky. Tento limit často vyžaduje úpravu destilovaného konopného extraktu (odstranění THC z výchozího extraktu) a lze ji dosáhnout pomocí preparativní chromatografie, např. pomocí systému puriFlash^® XL-Cannabis. HPLC analýza výchozího materiálu (destilátu), frakcí shromážděných během procesu čištění a konečného produktu může být provedena analytickým systémem Advion AVANT HPLC-UV. Jak čištění, tak analytické metody jsou uvedeny v této božuře a tvoří kompletní řešení pro odstranění THC v konopném průmyslu.