Базовые приготовления

После извлечения содержимого из матрицы можно приступить к подготовке проб для анализа ЖХ-МС/ГХ-МС.

Этот протокол лишь кратко описывает процедуру подготовки проб. Подробную процедуру можно найти в руководстве пользователя Metamino^®.

Анализ ЖХ-МС происходит следующим образом:

1. Отнесите пипеткой 100 мкл извлеченного содержимого (сыворотки, плазмы и т. д.) и добавьте 100 мкл среды осаждения. Центрифуга в течение 30–60 секунд при 1500 г (6000 об/мин).
2. Отнесите пипеткой 25 мкл осажденного образца и добавьте 10 мкл раствора внутреннего стандарта в каждый флакон для подготовки проб.
3. Внесите пипеткой 25 мкл раствора катализатора в каждый флакон для подготовки проб и перемешайте на вортексе в течение 5–10 секунд.
4. Внесите пипеткой 10 мкл раствора реагента в каждый флакон для подготовки проб и перемешайте на вортексе в течение 5–10 секунд. Разрешить дериватизации продолжаться в течение по крайней мере 2-3 минут.
5. Активируйте и уравновесьте сорбент в микроспиновом фильтре добавлением:
   1. 200 мкл среды активации MSPE, затем центрифугируйте в течение 30–60 секунд при 1500 g (6000 об/мин).
   2. 200 мкл уравновешивающей сорбентной среды MSPE, затем центрифугируйте в течение 30–60 секунд при 1500 g (6000 об/мин).
6. Вылейте элюат через мембрану.
7. Разбавьте реакционную смесь дериватизации 400 мкл среды для разбавления и промывки и перемешайте на вортексе в течение 5-10 секунд.
8. Разбавленную реакционную смесь (обычно 450-500 мкл) наносят на увлажненный сорбент микроспинового фильтра и оставляют на 1-2 минуты. Центрифуга в течение 30–60 секунд при 1500 г (6000 об/мин).
9. Вылейте элюат через мембрану.
10. Сорбент промывают на микроспиновом фильтре 200 мкл разбавленной и промывной среды и центрифугируют от 30 до 60 секунд при 1500 g (6000 об/мин).
11. Поместите микроспиновый фильтр в новый флакон для центрифуги, добавьте 200 мкл элюирующей среды и центрифугируйте в течение 30–60 секунд при 1500 г (6000 об/мин).
12. Перенесите элюат во флакон автосамплера. Образец готов к анализу ЖХ-МС.

ГХ-МС анализ происходит следующим образом:

1. Внесите пипеткой 25 мкл целевого образца и 10 мкл раствора внутреннего стандарта в каждую стеклянную реакционную пробирку.
2. Внесите пипеткой по 20 мкл восстановителя в каждую стеклянную реакционную пробирку и кратковременно перемешайте на вортексе в течение 5–10 секунд. Дайте постоять 1-2 минуты.
3. Внесите пипеткой по 25 мкл исходной среды в каждую реакционную стеклянную пробирку и добавьте 50 мкл раствора реагента (дериватизации) в каждую реакционную стеклянную пробирку и встряхивайте в течение 5–10 секунд.
4. Внесите пипеткой 25 мкл раствора катализатора в каждый флакон для подготовки проб и перемешайте на вортексе в течение 5–10 секунд.
5. Внесите пипеткой 25 мкл раствора катализатора в каждый флакон для подготовки проб и перемешайте на вортексе в течение 5–10 секунд. Дайте постоять 1-2 минуты. Эмульсия постепенно разделяется на два слоя.
6. Внесите пипеткой 50 мкл экстракционной среды в каждый флакон для подготовки проб и перемешайте на вортексе в течение 5–10 секунд.
7. Внесите пипеткой 25 мкл кислой среды в каждый флакон для подготовки проб и перемешайте на вортексе в течение 5–10 секунд. Затем центрифугируйте в течение 30–60 секунд при 1500 g (6000 об/мин).
8. Перенесите органический (верхний) слой (50–100 мкл) во флакон автосамплера с вкладышем. Образец готовят для анализа ГХ-МС.