Repromer Pb HPLC kolona, 9 μm, 250 x 8 mm

Firma Chromservis uvedla na trh novou řadu HPLC kolon na separaci cukrů, cukerných alkoholů a organických kyselin. Na trhu je množství kolon na analýzu sacharidů s různou selektivitou a principem separace. Na separaci cukrů, cukerných alkoholů a organických kyselin jsou na výběr 4 hlavní metody.

Důležité:

Rozdíly mezi těmito 4 typy kolon jsou hlavně v rozdílném elučním pořadí jednotlivých píků a separačních módech a elementech použitých na separaci. Existují 2 užitečná pravidla:

• u kolon Reprosil Carbohydrate, Repromer RCX a Reprosil-Pur C18-AQ eluují jako první molekuly malých cukrů a za nimi vyšší polysacharidy
• u polymerních kolon Reprogel a Repromer (H, Ca, K, Na, Pb) právě naopak, jako první euluují polysacharidy.

Separace monosacharidů se zlepšuje na kolonách Repromer od Na k Ca a k Pb formě. Pro oligosacharidy platí přesně opačné pravidlo, separace se zlepšuje na kolonách v pořadí Pb, Ca a Na.

Separační módy:

1. Separace na silikagelových fázích s amino skupinou (USP L8) probíhá na koloně Reprosil Carbohydrate při teplotách mezi 20 až 40 °C. Typickou mobilní fází je acetonitril : voda (okolo 70/30). Stabilita kolony je v rozsahu pH 3 až 7.
2. Separace na polymerních fázích s iontově-výměnným sorbentem probíhá na kolonách Repromer (dříve ReproGel), které obsahují sorbent plně sulfonovaný styrén-divinylbenzenový kopolymer kroslinkovaný 8% silným kationtovým iontoměničem. Jelikož je k dispozici několik iontových forem, jsou vhodné na separaci cukrů, cukerných alkoholů a organických kyselin:

• Repromer H (USP L17) cukry, cukerné alkoholy, organické kyseliny;
• Repromer Ca (USP L19) disacharidy, monosacharidy a cukerné alkoholy;
• Repromer Pb (USP L34) monosacharidy, mléčné vzorky s laktózou a laktulózou;
• Repromer Na (USP L58) mono a oligosacharidy;
• Repromer K.

Typickou mobilní fází je voda při vyšších teplotách (60 až 90 °C) pro všechny fáze nebo 5mM kyselina sírová (H2SO4) u kolony Repromer H při nižších teplotách. Detekce RI nebo UV (192–200 nm), tlak pod 100 bar.

3. Separace na polymerních anion-výměnných styrén-divinylbenzenových fázích při vysokém pH (USP L47) v izokratickém nebo gradientovém módu s detekcí PAD (pulzní ampérometrický detektor), CDD (vodivostní detektor) nebo RI.

• Repromer 10-RCX pro nižšícukry a cukerné alkoholy do DP8;
• Repromer 30 RCX pro vyšší cukry do DP15.

Typickou mobilní fází je 10–100mM hydroxid sodný (NaOH) nebo octan sodný při gradientové separaci, tlak pod 100 bar.

4. Separace na silikagelových fázích s C18 skupinou (USP L1) probíhá na kolóne Reprosil-Pur C18-AQ při teplotách mezi 20 a 40 °C. Typickou mobilní fází je voda pro cukry a 0,2M kyselina trihydrogenfos­forečná (H3PO4) pro organické kyseliny, tlak do 400 bar.